对虾偷死野田村病毒荧光定量RT-PCR检测方法

摘要

本发明涉及一种对虾偷死野田村病毒(CMNV)荧光定量逆转录PCR(RT-PCR)检测方法。本发明的方法是：针对CMNV的RNA依赖的RNA聚合酶基因保守基因片段设计引物和Taqman探针，制备RNA样品，按照预设的反应条件，进行荧光定量RT-PCR。通过标准曲线制作和检测方法的特异性验证，结果显示本发明的方法可以实现对CMNV的绝对定量，同时本方法能从白斑综合征病毒、杆状病毒、桃拉病毒、肝胰腺细小病毒、传染性皮下及造血组织坏事病毒和传染性肌肉坏死病毒中将CMNV准确鉴定出来，显示出高的特异性。本发明的引物、探针和检测方法对于加强水体、饵料和苗种中CMNV监测、防止该病毒大规模爆发流行具有很高的推广价值。

主权项

一种对虾偷死野田村病毒荧光定量RT‑PCR检测方法，包括如下步骤：1)将样品保存在饱和醋酸铵溶液中，采用RNA提取试剂盒制备RNA。2)采用一步法荧光定量RT‑PCR试剂盒配制反应液，其中反应体系总体积为25μL：反应缓冲液12.5μL，Taq HS混液为1μL，PrimeScript PLUS RTase混液为1μL，ROX参比染料为1ul和无RNase水为6.0μL，10mmol/Lde探针0.5μL，同时加入所述的两个引物和RNA，引物的终浓度为1μL，待检RNA为1μL。3)将上述反应液在实时荧光定量PCR系统上进行RT‑PCR反应，条件如下：逆转录反应：42℃，10分钟；95℃，10秒；PCR反应：95℃，5秒；60℃，30秒；40个循环。如果出现扩增曲线、Ct值小于35个循环且Tm值为81.53±0.14℃范围内可判断结果为阳性，否则即为阴性。