一种合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体和工程菌株的构建方法

摘要

本发明公开了一种利用分子生物学和基因工程的方法构建多倍体串联基因pBluescriptⅡKS-nPFWM、构建毕赤酵母串联表达载体pPICZαA-pBluescriptⅡKS-nPFWM及毕赤酵母工程菌株GS115-pPICZαA-pBluescriptⅡKS-nPFWM1的方法，其中n为1、2、4、6或12；为其后期高效、稳定表达抗氧化肽、工业化规模生产及其在化妆品、保健食品等领域应用奠定基础。

主权项

一种合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体和工程菌株的构建方法，其特征是包括以下步骤：(1)选取合浦珠母贝肉抗氧化肽PFMAP，根据其氨基酸序列并按照毕赤酵母偏好密码子设计出其对应的核苷酸序列，并进一步构建其核苷酸全长序列，根据全长序列，合成对应的两条单链，将两条单链进行PCR变性反应，获得合浦珠母贝肉抗氧化肽PFMAP目的基因，将PFMAP目的基因经限制性内切酶Xho Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切，与同样经Xho Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切的pBluescript Ⅱ KS质粒相连接，得重组载体，然后将重组载体经热激转化至DH5α感受态细胞，制得单倍体重组载体pBluescript Ⅱ KS‑PFMAP；(2)以单倍体重组载体pBluescript Ⅱ KS‑PFMAP为模板，加入上下游通用引物M13⁺、M13‑进行PCR特异性扩增，得到的PCR产物经电泳检测为单倍体目的条带基因pBluescript Ⅱ KS‑PFMAP，将目的条带基因pBluescript Ⅱ KS‑PFMAP经限制性内切酶Quick Xba Ⅰ和Quick Kpn Ⅰ双酶切后的基因，与同样经Quick Xba Ⅰ和Quick Kpn Ⅰ双酶切的pPICZαA质粒的基因相连接，制得合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体pPICZαA‑pBluescript Ⅱ KS‑PFMAP；(3)制备毕赤酵母菌GS115感受态细胞，将GS115感受态细胞与用限制性内切酶SacI单酶切线性化后的串联表达载体pPICZαA‑pBluescript Ⅱ KS‑PFMAP进行电转化和诱导培养，即制备得毕赤酵母工程菌株GS115‑pPICZαA‑pBluescript Ⅱ KS‑PFMAP。