一种利用RT-LAMP快速检测烟草轻型绿花叶病毒的方法

摘要

本发明提供了一种快速检测烟草轻型绿花叶病毒的方法，属植物保护领域。根据烟草轻型绿花叶病毒核苷酸序列设计RT-LAMP引物(TMG2-F3，TMG2-B3，TMG2-FIP，TMG2-BIP)。样品提取总RNA后，进行RT-LAMP反应，反应产物经电泳或者荧光染料的方法实现烟草轻型绿花叶病毒的检测。该方法操作简单，无需PCR仪等特殊仪器，同时又克服了传统的生物学、血清学等方法上存在的问题，是一种简捷、快速、灵敏而经济的检测方法。

主权项

一种利用RT‑LAMP快速检测烟草轻型绿花叶病毒的方法，包括以下步骤：(1)引物设计：根据NCBI上已报道的烟草轻型绿花叶病毒核酸序列设计引物，引物序列如下：TMG2‑F3：5`‑GGCAGTTGATTCTCAGAAGT‑3`TMG2‑B3：5`‑GCCCTTGTTTCCACACTT‑3`TMG2‑FIP：5`‑TGCGAGTCGAGATCCGAGAAA‑CTTTTCTTTACTAGGAAAACTCCAG‑3`TMG2‑BIP：5`‑TAAGTCACAGAACGAGTTTCATTGT‑ACTCGTTGAGACCCAATC‑3`(2)总RNA提取：参照Reagent(Invitrogen)使用说明书，提取病样(100mg样品/1mL TRIzol)总RNA。(3)RT‑LAMP反应：反应体系：总体系为25μL，其中RNA 2μL，BstDNA聚合酶(8U/μL)1μL，其它组分终浓度分别为TMG2‑F3和TMG2‑B30.2μmol/L；TMG2‑FIP和TMG2‑BIP 1.2μmol/L；Betaine 0.8mol/L；dNTPs 1.0mmol/L；KCl 10mmol/L；Tris‑HCl(PH 8.8，25℃)20mmol/L；(NH₄)₂SO₄ 10mmol/L；MgSO₄ 8mmol/L；0.1％TritonX‑100；M‑MuLV反转录酶100U；RNase Inhibitor 20U。反应条件：62℃恒温水浴锅60min；80℃5min。(4)检测：电泳检测：取5μL产物经1％琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液和150V电压条件下电泳20min，在0.5μg/mL的溴化乙锭(EB)中染色10min，染色后于凝胶成像系统中观察，在感染烟草轻型绿花叶病毒的样品中可以观察到明亮的呈弥散状的核酸泳带。或荧光染料：RT‑LAMP反应结束后，向其产物中加入SYBR Green I(1∶1000)2μ1，1‑5min后察结果，感染烟草轻型绿花叶病毒的样品变成绿色，而未感染样品及空白对照保持染料的橙色。