一种检测烟草土传真菌病原物的PCR引物及应用与方法

摘要

本发明公开了一种检测烟草土传真菌病原物的PCR引物及应用与方法，所述的检测烟草土传真菌病原物的PCR引物由烟草立枯病菌引物、黑胫病菌引物、根黑腐病菌引物和猝倒病菌引物组成；应用为所述的检测烟草土传真菌病原物的PCR引物在同时检测烟草4种土传真菌病原物中的应用，所述的4种土传真菌为烟草立枯病菌、黑胫病菌、根黑腐病菌和猝倒病菌；方法包括前处理、PCR反应、电泳检测步骤；本发明检测简便快速、灵敏度高、准确：4小时完成样品制备和检测，同时检测出烟草立枯病菌、黑胫病菌、根黑腐病菌、猝倒病菌等4种病原物，可以检测出0.01ng的病原物DNA样品，检测结果准确性高于传统的分离鉴定和症状鉴定方法。

主权项

一种同时检测烟草4种土传真菌病原物的方法，其特征在于所述4种土传真菌为烟草立枯病菌、黑胫病菌、根黑腐病菌和猝倒病菌，所述同时检测烟草4种土传真菌病原物方法包括前处理、PCR反应、电泳检测步骤：A、前处理：提取待检测烟草样品中的病菌DNA，无菌超纯水溶解DNA，调节DNA浓度为200ng/μL，制备样品DNA；B、PCR反应：以PCR引物对样品DNA进行多重PCR扩增；所述PCR引物由烟草立枯病菌引物、黑胫病菌引物、根黑腐病菌引物和猝倒病菌引物组成；所述的烟草立枯病菌引物的DNA序列为：上游引物P1：5′‑ GCACACTCTTCTCTTTCATCCA ‑3′；下游引物P2：5′‑ TTAGAAGCGGTTCGTCTGCA ‑3′；所述的黑胫病菌引物的DNA序列为：上游引物P3：5′‑ CGAAGCCAACCATACCACGAA ‑3′；下游引物P4：5′‑ ATGAAGAACGCTGCGAACTGC ‑3′；所述的根黑腐病菌引物的DNA序列为：上游引物P5：5′‑ AACGTACCTTTTCTAGCTGCTTTG ‑3′；下游引物P6：5′‑ TGAGGGTTTTTCGGCATGTTA ‑3′；所述的猝倒病菌引物的DNA序列为：上游引物P7：5′‑ TGGCTCCCTTTTCGGAGGAGA ‑3′；下游引物P8：5′‑ TTGCCCAGACCATTGCCTCA ‑3′；所述的多重PCR扩增的反应体系为：0.2μL浓度为5U/μL的TaKaRa La Taq；2.5μL 10×LA PCR Buffer II Mg²⁺Free；4.0μL浓度为25mM的MgCl₂；4.5μL浓度为2.5mM的dNTP Mixture；浓度为20μM的上下游引物P1~P8各0.5μL；1μL的DNA模板；加ddH₂O至25μL；反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸45s，30个循环，最后72℃延伸7min；C、电泳检测：PCR反应结束后，取产物做琼脂糖凝胶电泳检测，引物P1、P2特异性条带为541bp、引物P3、P4特异性条带为364bp、引物P5、P6特异性条带为400bp、引物P7、P8特异性条带为265bp，同时检测4种病原菌的灵敏度达到10^‑2ng/µL基因组DNA。