一种基于转录组测序开发菊属植物SSR引物的方法

摘要

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于转录组测序开发菊属植物SSR引物的方法。利用EST‐SSR的种间转移性，在转录组测序的基础上，结合Perl编程语言方法，对大量序列信息进行批量处理，进行SSR序列查找和SSR标记引物设计，克服了SSR开发效率低、耗时久、成本高等障碍。选择菊属不同种的材料对设计的SSR引物进行验证，若有条带检测出，即为成功的SSR引物。应用本方法成功地设计了1788对SSR引物，为菊属SSR引物开发进而实现分子标记辅助选择育种和比较基因组学研究提供了新的方法和思路。

主权项

一种基于转录组测序开发菊属植物SSR引物的方法，其特征在于包括：1）转录组数据的获得合成并纯化菊属植物cDNA，做末端修复、加A并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，选择大小为200‑700bp的片段用于下一步PCR扩增，最后进行PCR扩增，建好的测序文库用Illumina HiSeq™ 2000进行测序获得菊属植物转录组序列数据；2）SSR序列的识别安装Perl语言5.16版本，从 http://pgrc.ipk‑gatersleben.de/misa/下载est_timmer.pl并运行est_timmer.pl去除所述的转录组序列中过短的序列和过长的序列；所述的过短的序列指小于100bp的序列；所述的过长序列是指大于2000bp的序列；从http://www.bioinformatics.org/cd‑hit/ 中下载CD_HIT软件，利用其去除冗余序列；从http://pgrc.ipk‑gatersleben.de/misa/ 下载misa.pl程序以识别和定位序列中的SSR，参数设置如下：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重复次数至少为15、6、5、4、3；3）SSR引物的设计使用primer3模块http://sourceforge.net/projects/primer3/files/primer3/1.1.4/primer3 ‑1.1.4 ‑WINXP.zip/download批量设计SSR引物，引物设计参数为引物长度18‑22bp，Tm 55‑65℃，其中前后引物Tm值相差4℃，产物大小为100‑400bp；4）SSR引物在菊属植物内的有效性和通用性鉴定提取菊属及其近缘属不同野生种材料的DNA，利用引物开发所用材料的DNA进行设计引物有效性PCR鉴定，若有100‑400bp扩增子检测出，该引物即为有效引物；利用其近缘属不同野生种材料的DNA进行引物通用性鉴定，若有100‑400bp扩增子检测出，该引物即具有通用性；利用多对引物对菊属及其近缘属不同野生种材料的DNA进行PCR扩增，用于聚类分析验证整个体系的有效性和通用性；最终获得以下两对仅在菊属植物内通用且有效的引物：引物7：正向引物：SEQ ID NO.13，反向引物：SEQ ID NO.14；引物14：正向引物：SEQ ID NO.27，反向引物：SEQ ID NO.28。