一种含乳酸菌的复合益生菌饲料添加剂的制备方法

摘要

本发明涉及一种含乳酸菌的复合益生菌饲料添加剂的制备方法，该添加剂是由40-60％的嗜酸乳酸杆菌、15-20％的嗜淀粉乳酸杆菌、5-10％唾液乳酸杆菌、5-10％嗜热链球菌、5-10％多形拟杆菌和5-10％的葡萄糖经喷雾冷冻干燥复合形成。所有菌株均分离自猪肠道食糜。本发明中考虑了动物肠道的各个部分，将肠道前段产乳酸的乳酸菌与肠道后段分解纤维素和多糖的多形拟杆菌相结合，菌种间的配合比例与健康动物肠道中相应菌的组成相近，能更好地发挥彼此的优势，更好地促进动物的健康，提高饲料消化率，提高动物生产性能。

主权项

一种含乳酸菌的复合益生菌饲料添加剂的制备方法，该复合益生菌饲料添加剂是由40‑60％的嗜酸乳酸杆菌、15‑20％的嗜淀粉乳酸杆菌、5‑10％唾液乳酸杆菌、5‑10％嗜热链球菌、5‑10％多形拟杆菌和5‑10％的葡萄糖经喷雾冷冻干燥复合形成；所有菌株均分离自猪肠道食糜；其特征在于，包括以下步骤：A、动物肠道中嗜酸乳酸杆菌、嗜淀粉乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌、嗜热链球菌和多形拟杆菌的分离、纯化与鉴定：A1、样本的采集与稀释：无菌取猪空肠和盲肠内容物各1g，分别置于含有小玻璃珠的容量为50mL的灭菌三角瓶，按1∶10(g∶V)的比例加入灭菌生理盐水，充分振荡30分钟，使其成为均匀的悬液，此悬液为编号为10‑1的第一稀释度，另取灭菌小试管若干，每支加入灭菌生理盐水4.5mL，取10‑1稀释液0.5mL加入第二管混匀得编号为10‑2的第二稀释度，依次类推作递减稀释，得到编号为10‑11的最高稀释度；A2、配制选择性培养基：嗜酸乳酸杆菌、嗜淀粉乳酸杆菌和唾液乳酸杆菌的选择性培养基制备方法如下：酪朊水解物10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、柠檬酸二铵2g、吐温80 1.0mL、三水醋酸钠25g、磷酸二氢钾6g、七水硫酸镁0.58g、七水硫酸亚铁0.03g、四水硫酸‑锰0.15g、琼脂15g，调节pH至5.4，于121℃灭菌15min，倾注灭菌平皿，‑4℃保存备用；嗜热链球菌的选择性培养基制备方法如下：胰蛋白胨10g、大豆蛋白胨5g、牛肉浸膏5g、酵母浸膏5g、葡萄糖20g、氯化钠5g、L‑半胱氨酸盐酸盐0.3g、琼脂15g、蒸馏水1L，将以上成分加热溶于1L蒸馏水中，调节pH至6.1，于121℃灭菌15min，冷却至50℃， 加入试剂A和试剂B，所述试剂A为不含抗生素的脱脂奶粉10％水溶液100mL，经121℃灭菌5min而制得，所述试剂B为经过滤除菌的2％氯化三苯四唑(TTC)水溶液，前者试剂A100mL，后者试剂B10mL，混匀后倾注灭菌平皿，‑4℃保存备用；多形拟杆菌的分离选用NBGT血琼脂培养基其制备方法如下：马肉浸液930mL、蛋白胨10g、酵母浸膏5g、葡萄糖1.5g、L‑胱氨酸0.2g、L‑半胱氨酸0.5g、牛磺胆酸钠1g、琼脂15g，将各固体成分加热溶化于马肉浸液中，调pH至7.8，于121℃灭菌15min，冷却至50℃，每95mL，以无菌操作加入浓度为2mg/mL的新霉素水溶液0.2mL，0.1％煌绿水溶液0.1mL和脱纤维马血5mL，混匀后倾注灭菌平皿，于‑4℃下保存备用；A3、接种：选择编号为10‑5、10‑6和10‑7三个稀释度进行接种，每个稀释度接种三个平皿，每个平皿接种100uL悬浊液，接种后用涂布器涂布均匀，空肠内容物接种于嗜酸乳酸杆菌、嗜淀粉乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌的选择性培养基和嗜热链球菌的选择性培养基，接种后于37℃恒温厌氧倒置培养48‑72h；盲肠内容物接种于NBGT血琼脂培养基，接种后于37℃恒温厌氧倒置培养76h；培养结束后于平皿中选择疑似菌落在相应的培养基上进行划线培养，以达到纯化菌种的目的；A4、鉴定：提取纯化后各菌株的DNA和16S rRNA进行碱基序列分析，并用BLAST软件包中的Clustal W程序与GeneBank中的碱基序列进行对比，DNA序列相似度大于70％且16S rRNA序列相似度大于90％时判定为该菌株；B、扩大培养B1、一次扩培：一次扩培培养基制备方法如下：嗜酸乳酸杆菌、嗜淀粉乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌和嗜热链球菌的扩培培养基配方如下：大豆蛋白胨50g、牛肉浸膏50g、酵母浸膏50g、葡萄糖200g、乳糖20g、鲜柑桔汁50mL，将以上组份溶解于1L去离子水中，于121℃条件下灭菌20min，冷却后‑4℃保存备用；多形拟杆菌扩培培养基配方如下：酪蛋白胨10g、大豆蛋白胨3g、蛋白胨10g、酵母浸膏5g、牛肉浸膏2.2g、葡萄糖3g、磷酸二氢钠2.5g、血清消化蛋白胨或消化血液13.5g、氯化钠3g、可溶性淀粉5g、L‑半胱氨酸0.3g、硫乙醇酸‑钠0.3g，将以上组份溶解于1L去离子水中，调节pH至7.3，于121℃条件下灭菌15min，冷却后‑4℃保存备用；将一次扩培培养基分装于100mL培养瓶中，每瓶分装20mL，用接种丝挑取经鉴定后的嗜酸乳酸杆菌、嗜淀粉乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌和嗜热链球菌菌落，分别接种到培养基中，在36℃下，一个大气压的90％氮气+10％二氧化碳环境中厌氧静置培养16‑18h，待pH为3.8‑4.5时，一次扩培完成；多形拟杆菌于37℃条件下，厌氧静置培养76h；B2、二次扩培：二次扩培培养基制备方法如下：嗜酸乳酸杆菌、嗜淀粉乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌和嗜热链球菌的扩培培养基配方如下：大豆蛋白胨200g、棉籽糖20g、鲜柑桔汁100mL、氯化钠10g，将以上组份溶解于2L蒸馏水中，放置到容量为4L的小型发酵罐中，于121℃条件下灭菌20min备用；多形拟杆菌二次扩培培养基配方如下：胰化酪蛋白胨150g、大豆蛋白胨50g、磷酸氢二钾25g、氯化钠50g、可溶性淀粉5g、L‑半胱氨酸0.3g、硫乙醇酸‑钠0.3g，将以上组份溶解于1L去离子水中，调节pH至7.3，放置于2L的小型发酵罐中，于121℃条件下灭菌15min备用；将各个菌株的一次扩培发酵液同时接种到二次扩培培养基中，乳酸菌在40℃温度下恒温厌氧静置培养12‑14h，pH达3.8‑4.5时完成二次扩培；多形拟杆菌在37℃下恒温厌氧静置培养48h后完成二次扩培；B3、收集发酵菌泥：将二次扩培得到的发酵液无菌操作装入离心管中，25℃条件下，10000rpm/min离心5min，弃去上清液，所得离心沉淀物即为菌泥，用1％蛋白胨水溶液将菌泥重新悬浮成为悬浊液，且使细菌浓度为10⁹cfu/mL；B4、喷雾急速冷凝法对各菌株进行微胶囊包被处理；B41、海藻酸盐混合物的制备：将海藻酸钠2％(w/v)、MRS肉汤5.5％(w/v)，甘油5％(w/v)、黄原胶0.26％(w/v)、吐温20 0.1％(w/v)和细菌悬浊液20％(w/v)加入一定量的蒸馏水中混匀即得；B42、将以上混合物注入雾化器中雾化，雾化时空气压力为0.6kgf/cm²，液体压力为0.4kgf/cm²；B43、雾化后的液体微滴用装有适量浓度为0.5mol/L的氯化钙溶液的收集槽中，收集过程中通过磁力搅拌器轻轻搅拌氯化钙溶液；B44、液体微滴在氯化钙溶液中硬化15min，然后用高密筛网过滤，并用蒸馏水洗涤两次，然后再转入壳聚糖乳酸溶液中，轻轻搅拌15min使海藻酸盐微胶囊表面被均匀包被；B45、再将B44处理后的微胶囊过滤并洗涤后，于‑72℃冷冻干燥6h，然后于‑75℃再干燥18h，干燥时压力设定为5.33Pa。