快速获得盐生草叶片原生质体的方法

摘要

本发明涉及一种盐生草原生质体的制备及纯化的方法，它包括以下步骤：1.幼苗的种植；2.叶片的选取；3.原生质体的获得，用刀片沿其主脉纵切，然后放入酶解液中；4.原生质体的纯化，酶解后，加入等体积的洗液，最后用移液枪吸取4-5ml的上清液，即为较纯的原生质体；5.原生质体产量的测定，根据加入酶溶液中叶片的多少计算出每克叶片得到的原生质体产量，计算结果以每克叶片原生质体数表示(个/g)。本发明简单易行，获得的原生质体纯度高，数量可达8.4×10⁴个/g,也可避免组培污染，能为体细胞的杂交，各种细胞器(如细胞核，叶绿体，线粒体，液泡等)的分离，生物反应器的构建以及原生质体融合育种等奠定基础。

主权项

一种快速获得盐生草叶片原生质体的方法，其特征在于步骤为：(1)幼苗的种植，选取饱满的盐生草种子3‑5月种植于花盆，其蛭石与沙子体积比为1:1‑3:1；(2)叶片的选取，待步骤(1)获得的幼苗长至1‑3个月，用刀片切取靠近植株基部2/3处的叶片，蒸馏水冲洗三次，待用；(3)原生质体的获得，将步骤(2)获得的叶片用滤纸擦干，用刀片沿叶片主脉纵切，然后放入酶解液中,22‑25℃，黑暗条件下酶解2‑3h；(4)原生质体的纯化，在步骤(3)酶解后的酶解液中加入等体积的洗液，放置在黑暗条件下，22‑25℃，25‑40rpm的水平摇床10‑15min,然后用5ml的移液枪将酶解液吸入10ml的试管，接着将其放入22‑25℃的离心机2000‑3000r离心8‑10min，最后用移液枪吸取4‑5ml的上清液，即为纯的原生质体；(5)原生质体产量的测定，吹打步骤(4)所述原生质体，使其分布均匀，用移液枪吸取一滴在血球计数板上，盖上盖玻片，置于倒置显微镜下计数，连续计数三次，取平均值；根据加入酶溶液中叶片的多少计算出每克叶片得到的原生质体产量，计算结果以每克叶片原生质体数表示个/g。