水牛睾丸曲精细管总蛋白样品的制备方法和双向电泳分离方法

摘要

本发明公开了一种水牛睾丸曲精细管总蛋白样品的制备方法，该法属于裂解液提取-丙酮沉淀方法，且方法简单易行、快速可靠，结合使用组合酶有效消化和去除了睾丸肌肉组织、结缔组织等多种组织成分以及DNA等，最终将大量白色的睾丸曲精细管富集出来，获得的曲精细管较纯且不含其它杂质，提取的总蛋白质量较好，适合于双向电泳分析。据此，发明人通过不断摸索和优化双向电泳技术体系，从而建立了一套水牛睾丸曲精细管总蛋白样品的双向电泳分离方法，该法可获得质量较好、分辨率较高的双向电泳图谱，对于后续的质谱分析和蛋白鉴定具有非常重要的应用价值。

主权项

一种水牛睾丸曲精细管总蛋白样品的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)用体积浓度75％酒精消毒水牛阴囊皮肤，切开阴囊并剥离其周围组织，取出睾丸，置于37℃生理盐水中保存并迅速带回实验室；用PBS反复冲洗3次，去掉被膜、白膜，剪取一小块睾丸实质，用镊子将组织慢慢撕开并置于15mL玻璃管中；(2)向步骤(1)的15mL玻璃管中加入胶原酶Ⅳ和DNaseⅠ的混合酶溶液，使睾丸组织与混合酶溶液的质量体积比为1:10，置于37℃摇床上震摇2～3h，直到看到大量白色的曲精细管富集于管底时停止摇晃，轻轻倒掉上清液，用PBS溶液冲洗2～3次，将纯化后的曲精细管样品分装于1.5mL离心管中；(3)向步骤(2)的1.5mL离心管中加入纯化的曲精细管样品3～5倍体积的蛋白裂解液，冰浴下震摇30min至曲精细管样品充分裂解，4℃、12000g离心10min，收集上清液；所述蛋白裂解液组成为7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4％CHAPS和1％DTT；(4)向步骤(3)收集的上清液中加入4倍预冷丙酮，‑20℃静置2～3h或过夜，4℃、12000g离心30min，弃上清，再用预冷丙酮洗涤沉淀2～3次，室温放置10min使残余丙酮尽可能完全挥发，蛋白沉淀用水化液复溶，Bradford法测定蛋白质浓度，‑80℃保存备用。