肺炎嗜衣原体特异性抗原多肽的制备方法

摘要

本发明公开了肺炎嗜衣原体特异性抗原多肽的制备方法，通过肺炎嗜衣原体蛋白酶样活性因子CPAF(1-250)特异性抗原多肽，含该多肽的融合蛋白，其编码DNA，携带该DNA的重组载体，含该重组载体的转化子，产生抗体的方法，检测或测定抗体的方法和试剂，诊断肺炎嗜衣原体感染的方法和试剂。本发明可用于重组抗原的表达、医学临床病原微生物肺炎嗜衣原体感染者的诊断，特别是体外肺炎嗜衣原体诊断试剂的开发。

主权项

一种肺炎嗜衣原体特异性抗原多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)抗原片段的获得：利用生物信息学方法，在开始的生物信息资源数据库上收集肺炎嗜衣原体、沙眼衣原体以及鹦鹉热衣原体的衣原体蛋白酶样活性因子的同源蛋白质序列，运用多序列比对程序clustalw进行多序列比对分析，肺炎嗜衣原体、沙眼衣原体以及鹦鹉热衣原体多种同源CPAF蛋白，寻找肺炎嗜衣原体最特异性的片段，随后进行抗原表位分析，寻找到了优势特异性CPAF的蛋白表达区段Met1‑Ser250，并进一步做原核载体的构建与表达纯化；(2)抗原蛋白的获得；从CPAF编码基因调取相对应的基因核酸片段，总长度为750bp，并利用其进行亚克隆构建到原核表达重组质粒pGEX‑4T‑2中，通过调整诱导表达条件，确定蛋白质表达的最佳条件为：37度1mM IPTG诱导表达4小时之后收集菌体，并通过蛋白质纯化，得到高纯度的重组蛋白质，此蛋白质为N端谷胱转移酶融合蛋白，其重组蛋白通过SDS‑PAGE鉴定纯度；(3)特异性抗体制备：将原核表达纯化得到的纯度大于95％的重组蛋白除去内毒素，再进行动物免疫，通过三次腹腔注射重组蛋白使小鼠对其产生免疫反应，取小鼠腹水纯化得到抗血清，经过进一步的纯化与分离得到多克隆抗体，将CPAF(1‑250)特异性抗原免疫小鼠后，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，经多次筛选获得阳性的单克隆细胞株，并进行腹水生产和单克隆抗体制备。