一种稻飞虱血淋巴内病毒蛋白的免疫荧光标记检测方法

摘要

本发明属于农业生物技术蛋白检测领域的检测技术，公开了一种稻飞虱血淋巴内病毒蛋白的免疫荧光标记检测方法，可用于检测稻飞虱传播的病毒在其血淋巴内的分布。本发明可对稻飞虱的血淋巴直接进行免疫荧光标记检测病毒的分布，从而用于分析病毒在稻飞虱体血淋巴内的侵染。该方法通过对稻飞虱血淋巴的抽取，并对抽取到的血淋巴吸附在经多聚赖氨酸处理的防脱载玻片上，经固定、渗透、抗体孵育、制片和观察，从而检测稻飞虱血淋巴内的病毒。本发明解决了常规RT-PCR无法检测稻飞虱血淋巴内病毒的难题，使稻飞虱体内微量的血淋巴可通过免疫荧光标记技术直观准确地检测侵入其中的病毒。

主权项

一种稻飞虱血淋巴内病毒蛋白的免疫荧光标记检测方法，其特征在于：通过对稻飞虱血淋巴的抽取，并对抽取到的血淋巴吸附在经多聚赖氨酸处理的防脱载玻片上，经固定、渗透、抗体孵育、制片和观察，从而检测稻飞虱血淋巴内的病毒；方法包括以下步骤：1）昆虫饲毒：抓取100头室内饲养的2龄稻飞虱若虫，于水稻病毒侵染的水稻病株上饲喂2天，随后在健康水稻幼苗上饲养，饲养的不同时间点抓取20头稻飞虱用于检测稻飞虱血淋巴内的病毒；2）Poly‑L‑lysine玻片的制备：将清洗洁净的圆形玻片用碱液浸泡2小时，双蒸水洗涤5次；再用无水乙醇浸泡30 min，烘干；将玻片放入24孔板中，并向每个孔加入poly‑L‑lysine溶液，室温孵育2小时；用移液枪吸去孔中的液体，并用双蒸水清洗3次；将玻片放置在24孔板孔沿上，使玻片的两面都暴露在空气中，放置24小时后即可用于吸附血淋巴；3）抽取稻飞虱的血淋巴：将活体昆虫装入玻璃试管，放在冰上使昆虫低温麻醉，然后将麻醉后的稻飞虱倒出并粘附在玻璃胶面上，用解剖镊拔去稻飞虱一侧的后足，吸取1‑2μl 0.01 mol/L PBS溶液，在稻飞虱拔除后足的伤口处反复吸打3‑5次，抽取出稻飞虱的血淋巴；4）吸附：将获得的稻飞虱血淋巴滴在处理后的Poly‑L‑lysine玻片上，28～35℃培养箱内放置40～50 min，使血淋巴吸附在玻片上；5）固定：将吸附后的玻片放入装有200μl固定液的离心管中，静置10‑20 min；6）渗透：固定后的玻片用pH值为7.2的0.01 mol/L PBS溶液清洗两次，再滴加200 μl渗透液处理10‑30 min；7）配制抗体标记液：将荧光抗体与抗体稀释液按1:100的体积比混合，制得荧光抗体标记液，并用锡箔纸包裹避光；每个玻片需30～50 μl抗体标记液；8）抗体孵育：用pH值为7.2的0.01 mol/L PBS溶液清洗渗透后的玻片两次，将荧光抗体标记液滴加在清洗后的玻片上，于37℃恒温孵育45‑60 min；9）制片：孵育结束后，再次用pH值为7.2的0.01mol/L PBS溶液清洗玻片两次；向空白洁净的载玻片上加入一滴抗衰减液，将清洗后的玻片反盖在抗衰减液上；10）观察：在荧光显微镜下观察血淋巴内的病毒蛋白，判断病毒是否侵染稻飞虱血淋巴。