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一种托品酰胺人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1) 制备人工半抗原：(a) 将托品酰胺与丁二酸酐以摩尔比为1:1.5加入单口圆底烧瓶中，用吡啶溶解，在100℃油浴下，搅拌回流20小时；结束反应，冷却至室温，减压转干，并用少量乙醇共沸，浓缩后，经薄层色谱法分离得微黄色固体产物Ⅰ；薄层层析：层析液以体积比计为95%乙醇:1,4‑二氧六环:二氯甲烷:氨水=8:1:10:1，产物Rf =0.3；(b) 将产物Ⅰ与甘氨酸乙酯盐酸盐和1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐以摩尔比为1:1.15:2溶于吡啶中，氮气气氛中，室温搅拌反应18小时；反应结束，转干，用少量乙醇共沸，得到的残渣加入PBS，用氯仿萃取两次，得到的有机相再用双蒸水洗，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，转干得黄色油状物Ⅱ；薄层层析：层析液以体积比计为95%乙醇:1,4‑二氧六环:二氯甲烷:氨水=8:1:10:1，产物Rf =0.7；(c) 将黄色油状物Ⅱ溶于四氢呋喃和甲醇中，加入1N的NaOH水溶液，室温搅拌反应4小时；结束反应，蒸干溶剂，用1N的盐酸调pH=3，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤，转干得黄色油状残渣，经薄层色谱分离得黄色油状物Ⅲ即托品酰胺半抗原；薄层层析：层析液以体积比计为95%乙醇:1,4‑二氧六环:二氯甲烷:氨水=8:1:10:1，产物Rf =0.2；(2) 制备托品酰胺人工抗原：(d) 将托品酰胺半抗原Ⅲ溶于N,N‑二甲基甲酰胺，随后加入三乙胺和氯甲酸乙丁酯，室温避光搅拌反应15小时，形成溶液A；(e) 将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78.3:4.2:1溶于双蒸水中，制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.2~7.4；(f) 将牛丙种球蛋白溶于PBS缓冲液中，浓度为5mg/ml，形成B液；(g) 将溶液A缓慢逐滴滴加到溶液B中，边滴边搅拌，A液与B液的体积比为1:5，室温搅拌反应0.5小时，得到的混合液在4℃条件下静置保存18小时，得到人工抗原混合液；(h) 将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：托品酰胺‑牛丙种球蛋白。 |
