一种重组人表皮生长因子原液生产工艺

摘要

本发明公开了一种重组人表皮生长因子原液生产工艺，该培养基由以下重量比例成分制成：甘油5.0-7.0％、酵母碱基(YNB)3.0-3.5％、微量金属离子1.8-2.2％、诱导剂1.2-1.8％、生物素0.5-1.0％、促进剂0.5-1.0％、水余量；所述微量金属离子为三氯化铁、氯化钙、钼酸钠、氯化锌、硫酸铜、硼酸、硫酸铝中的一种；用磷酸盐缓冲液调pH为5.5-6.5。本发明使用的植物原料成分经过了蒸汽爆破、蒸馏、高剪切均质机处理，得到纳米乳状的植物油性成分，和培养基中其他配方的相容性好。本发明通过在培养基中添加植物原料成分作为促进剂，和现有技术相比，发酵液的产量会提高31-42％。

主权项

一种重组人表皮生长因子原液生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：1)培养基的准备：由以下重量比例成分制成：所述微量金属离子为三氯化铁、氯化钙、钼酸钠、氯化锌、硫酸铜、硼酸、硫酸铝中的一种；用磷酸盐缓冲液调pH为5.5‑6.5；所述促进剂采用以下方法制备：①原料处理：将穿心莲和金银花按照等重混合、洗净、干制、粉碎；②蒸汽爆破处理：将步骤①得到的物料放入蒸汽爆破罐，爆破压力3.0‑3.5Mpa，保压时间维持在150‑200s；③蒸馏处理：将步骤②得到的物料放入蒸馏器，在蒸馏器底部，加热燃烧或通入蒸汽，当炙热的蒸气充满在蒸馏器里，水蒸气通过冷凝管，被引入冷凝器内，再通过油水分离器，收集精油；④高剪切均质机处理：将步骤③得到的精油通过高剪切均质机处理，线速度30‑40m/s，时间3‑5min，制成纳米乳，并用微孔滤膜过滤除菌得到；2)发酵、表达：应用2L摇瓶及20L原位灭菌发酵罐培养遗传工程菌株，以1O％培养基接种后，添加诱导剂，30℃培养，控制pH7.0，氧饱和度10‑50％，搅拌150‑170rpm，罐压0.01378‑0.03445MPa，流加甘油至每L湿菌达100‑300g后流加甲醇保持其浓度为1％以进行EGF的诱导表达；3)分离：表达结束，离心分离，既得重组克隆菌株离心液；4)纯化：将步骤3)得到的重组克隆菌株离心液，加入硫酸铵使浓度成0.5M，上样于用5倍柱体积量的20mM磷酸缓冲液pH7.0，0.5M硫酸胺溶液平衡过的疏水柱，以20mM磷酸缓冲液pH7.0,0.5M硫酸胺将进样峰洗至基线，以20mM磷酸缓冲液洗脱出EGF峰，该样品峰以20mM Tris‑HCl pH7.6缓冲液稀释10倍后上样于Q‑sepharose High Performance柱，以A液(20mM Tris‑HCl pH7.6)至B液(20mM Tris‑HC1pH7.6，0.5MNaCl)梯度洗脱方法收集EGF峰，最后用分子筛Superdex 30柱纯化重组hEGF蛋白，纯度可达98％以上。