一种新的基因组简化甲基化测序文库的制备方法

摘要

本发明公开了一种新的基因组简化甲基化测序文库的制备方法，该方法为：分别选取EcoRI/MspI和EcoRI/HapII两种双酶切组合对基因组DNA进行酶切，酶切后的片段进行纯化；设计特异的接头引物，对纯化后的DNA片段进行连接；连接后的产物分成两组，混合成两个池；将混合池样本进行纯化和琼脂糖凝胶电泳回收300～400bp的片段；利用所设计的特异PCR引物，对回收后的片段进行PCR富集和琼脂糖凝胶电泳回收，即得到测序文库。本发明具有高覆盖率、低冗余、高灵敏度、大规模样品、高性价比、结果可靠性高、实验可重复性好等优点，普遍适于常规分子生物学实验室进行各种基因组甲基化差异研究。

主权项

一种新的基因组简化甲基化测序文库的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)提取同一物种不同组织或者相同组织不同发育时期的基因组DNA；(2)分别选取EcoRI/MspI和EcoRI/HpaII两种双酶切组合对不同样品的基因组DNA进行酶切；对酶切后的片段进行纯化；(3)用T4DNA连接酶连接EcoRI接头、纯化的酶切片段、MspI(HpaII)接头；EcoRI接头、MspI(HpaII)接头的序列如下：EcoR接头序列为：F1(5’‑3’)：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNN，R1(5’‑3’)：/5Phos/AATTNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT；MspI/HpaII接头序列为：F2(5’‑3’)：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，R2(5’‑3’)：/5Phos/CGAGATCGGAAGAGCGAGAACAA；其中，EcoRI接头序列中的NNNNN代表条码序列，F1、R1引物中的NNNNN为互补的序列，条码信息见表1，表1中条码序列与F1上的NNNNN五碱基序列相同，R1的NNNNN序列与条码序列反向互补；/5Phos/代表5’端起始碱基为磷酸基团修饰；表1.条码和指示标签信息表条码编号条码序列条码编号条码序列指示标签编号指示标签序列条码1GCATG条码25CTGCG指示标签1ATCACG条码2AACCA条码26CTGTC指示标签2CGATGT条码3CGATC条码27CTTGG指示标签3TTAGGC条码4TCGAT条码28GACAC指示标签4TGACCA条码5TGCAT条码29GAGAT指示标签5ACAGTG条码6CAACC条码30GAGTC指示标签6GCCAAT条码7GGTTG条码31GCCGT指示标签7CAGATC条码8AAGGA条码32GCTGA指示标签8ACTTGA条码9AGCTA条码33GGATA指示标签9GATCAG条码10ACACA条码34GGCCA指示标签10TAGCTT条码11AATTA条码35GGCTC指示标签11GGCTAC条码12ACGGT条码36GTAGT指示标签12CTTGTA条码13ACTGG条码37GTCCG指示标签13AGTCAA条码14ACTTC条码38GTCGA指示标签14AGTTCC条码15ATACG条码39TACCG指示标签15ATGTCA条码16ATGAG条码40TACGT指示标签16CCGTCC条码17ATTAC条码41TAGTA指示标签17GTCCGC条码18CATAT条码42TATAC指示标签18GTGAAA条码19CGAAT条码43TCACG指示标签19GTGGCC条码20CGGCT条码44TCAGT指示标签20GTTTCG条码21CGGTA条码45TCCGG指示标签21CGTACG条码22CGTAC条码46TCTGC指示标签22GAGTGG条码23CGTCG条码47TGGAA指示标签23ACTGAT条码24CTGAT条码48TTACC指示标签24ATTCCT(4)分别将EcoRI/MspI酶切连接组和EcoRI/HpaII酶切连接组连接产物混合成两个池，将两个池样本进行纯化，纯化后的样本进行琼脂糖凝胶电泳，电泳完成后切胶回收片段大小为300～400bp的DNA片段；(5)利用含指示标签序列的PCR引物对回收的片段进行PCR富集，PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳回收350～450bp的片段，回收的片段即为测序文库；PCR引物序列为：F3(5’‑3’):AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG，R3(5’‑3’):CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC；其中，PCR引物R3序列中的NNNNNN代表指示标签序列，指示标签信息见表1，表1中指示标签序列与R3引物中的NNNNNN六碱基序列反向互补。