全长cDNA核酸线性扩增方法及试剂盒

摘要

本发明涉及分子生物学领域，具体公开了一种全长cDNA核酸线性扩增方法，通过mRNA分离纯化；逆转录合成第一链cDNA；第一链cDNA 3'末端延伸，获得全长第一链cDNA；全长第一链cDNA富集纯化；双链cDNA的合成等步骤，合成两端序列已知的全长cDNA。本发明的全长cDNA核酸线性扩增方法灵敏度高、方法简单，适用于全长cDNA的高效合成。

主权项

一种cDNA核酸扩增方法，其步骤为：(1)mRNA分离纯化；所述步骤(1)具体为：取适量的总RNA或细胞裂解液于反应管内，加热变性，加入生物素标记的Oligo dT接头引物后退火；向反应管中加入亲和链霉素标记的磁珠进行反应，收集磁珠获得纯化的mRNA；所述Oligo dT接头引物长度为25～80bp，其序列自5’端至3’端方向依次包含左端接头序列，寡聚胸腺嘧啶序列，以及简并核苷酸序列VN；(2)逆转录合成5’端序列已知的第一链cDNA；所述步骤(2)具体为：向收集有磁珠的反应管中加入逆转录所需试剂进行逆转录反应，反应结束后降解mRNA并收集磁珠，获得纯化的5’端序列已知的第一链cDNA；所述步骤(2)的逆转录反应还加入了辅助因子，所述辅助因子序列如SEQ ID NO：1或2所示；(3)5’端序列已知的第一链cDNA 3'末端延伸，获得全长第一链cDNA；所述步骤(3)具体为：向步骤(2)获得的5’端序列已知的第一链cDNA中加入Oligo修饰引物，变性，退火后，加入PCR反应所需试剂进行cDNA 3'末端延伸反应，获得两端序列已知的全长第一链cDNA；所述Oligo修饰引物长度为20～50bp，其序列自5’端至3’端方向依次包含右端接头序列和随机引物序列，并且所述Oligo修饰引物3’端最外侧的碱基被修饰，或者所述Oligo修饰引物3’端最外侧的碱基及与之连续的多个碱基被修饰；(4)全长第一链cDNA富集纯化；所述步骤(4)具体为：对上一步获得的反应液加热变性，收集磁珠获得纯化的全长第一链cDNA；(5)双链cDNA的合成或RNA的转录；所述步骤(5)具体为：通过PCR的方法或者体外转录法，以前一步骤获得的全长第一链cDNA为模板，设计锚定引物，合成两端序列已知的全长双链DNA；或者以前一步骤获得的纯化的全长第一链cDNA为模板，设计锚定引物，合成dsDNA，纯化后进行体外转录反应合成RNA。