一种强热稳定性的中性蛋白酶

摘要

本发明公开了一种强热稳定性的中性蛋白酶，属于酶制剂制备技术领域。以产强热稳定性中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌1398-2-12为出发菌株，并进行培养基优化和发酵工艺改进，经液体深层混合发酵，制得一种热稳定性强、酶活力较高的中性蛋白酶。发酵液酶活5500-7000U/mL，最适反应温度为70℃；在pH值为4.5-8.5时酶活完全稳定，最适反应pH值为7.2；在70℃条件下保存1h后保持80%以上酶活，75℃条件下保存1h后保持70%以上酶活。比现有的中性蛋白酶热稳定性强，酶活力较高，酶作用最适pH值范围宽泛，储存稳定性高，特别适合反应温度高，蛋白分解与糖化、液化工艺并存的工业化需求。

主权项

一种强热稳定性中性蛋白酶，其特征在于，其酶学性质如下：(1)温度：该酶最适作用温度为70℃，在40‑70℃之间具有较高的酶活；(2)pH：该酶最适反应pH值为7.2，在pH值为4.5‑8.5时酶活完全稳定；(3)酶活性：发酵液中性蛋白酶酶活可达5500‑7000U/mL，是出发菌株的2.5倍；(4)热稳定性：该酶在70℃条件下保存1h后仍能保持80％以上酶活，75℃条件下保存1h后保持70％以上酶活；(5)存储稳定性：该酶在室温下保存12个月后酶活损失小于2.5％；所述中性蛋白酶由枯草芽孢杆菌1398‑2‑12经液体深层发酵制备，该菌种保藏编号为：CCTCC M 2013539；所述中性蛋白酶的制备方法如下：枯草芽孢杆菌1398‑2‑12经菌种活化和逐级扩大培养获得液体种子；将液体种子以6％接种量接入发酵罐，培养温度30‑36℃，搅拌速度200‑700r/m，通风量(V/V)1:1‑3,培养时间10‑15h；然后以1‑2℃/h降温速率缓慢降温至10‑15℃，恒温培养15‑20h；继续以1‑2℃/h降温速率缓慢降温至2‑5℃，此时，将液体种子以4％接种量追加接入发酵罐，恒温培养20‑30h；最后以1‑2℃/h升温速率缓慢升温至10‑15℃，恒温培养15‑20h；继续以1‑2℃/h升温速率缓慢升温至30‑36℃，恒温培养15‑20h；发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得固体中性蛋白酶；所述调配过程加入浓缩酶液总重量0.5‑5％中草药粉剂；所述中草药粉剂的制备方法如下：称取黄芪20‑30份；党参10‑18份；柴胡10‑15份；黄芩10‑15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3‑6倍重量的水，控制温度70℃‑90℃保持2‑4h，然后降温至45‑60℃，加入混合物料总重量5‑10％的混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为5.5‑6.8，酶解2‑4h，最后添加混合物料0.5‑3倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1‑1.5，控制温度至60℃‑78℃保持3‑4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；所述混合酶制剂的重量份数组成为：内β‑葡聚糖酶10‑20份，外β‑葡聚糖酶10‑20份，β‑葡萄糖苷酶10‑15份，木聚糖酶15‑20份，戊聚糖酶15‑20份，普鲁兰酶20‑30份，β‑淀粉酶10‑15份，中性蛋白酶10‑15份，酸性蛋白酶10‑15份，超氧化物歧化酶5‑10份，葡萄糖氧化酶5‑10份，酸性磷酸酶5‑10份。