一种链霉菌生物合成调控蛋白的体外筛选方法

摘要

本发明提供一种链霉菌生物合成调控蛋白的体外筛选方法，将培养的链霉菌细胞破碎，得到链霉菌全蛋白质组溶液，将有生物素标记的dptE基因启动子DNA片段与链亲和素耦合的琼脂糖相结合后，再与蛋白质组溶液相互混合，经亲和结合与洗脱后，得到链霉菌中与目的DNA片段相互结合的蛋白质溶液。最后，经胰酶消化后，再使用高效液相色谱以及串联质谱（HPLC-MS/MS）的方法对结合蛋白的氨基酸残基进行分析，获得部分肽段序列，通过比对从而精确确定与目的DNA片段相结合的调控因子。本发明筛选未知调控蛋白，该方法高效，准确，操作方便，为链霉菌体内调控因子的筛选提供了一种新的研究手段。

主权项

一种链霉菌生物合成调控蛋白的体外筛选方法，其特征在于，通过以下步骤实现：（1）将链霉菌在TSB液体培养基中培养24～48小时后，以5000rpm速度离心5分钟收集细胞，用蛋白结合液重悬成悬液，将悬液超声破碎后，于4℃条件下12000rpm速度离心10分钟，取上清，并用直径0.45微米的微孔滤膜过滤上清，得到蛋白质组溶液备用；（2）制备生物素标记的载体DNA片段和生物素标记的载体片段与目的片段融合DNA；（3）将链亲和素耦合的琼脂糖与生物素标记的载体片段DNA在蛋白结合液中混合，置于亲和层析柱中，于25℃摇动结合30分钟后，弃去上清；（4）将蛋白质组溶液加入（3）中的亲和层析柱中，25℃摇动结合30分钟后，过滤取上清；（5）将链亲和素琼脂糖和生物素标记的载体片段与目的片段融合的DNA在蛋白结合液中混合，置于亲和层析柱中，于25℃摇动结合30分钟后，弃去上清；（6）将（4）中得到蛋白质组溶液加入（5）中的亲和层析柱中，25℃摇动，与载有生物素标记的载体片段与目的片段融合DNA的链亲和素琼脂糖结合30分钟后，过滤并弃上清；（7）使用蛋白结合液将（6）中的亲和层析柱过滤洗涤两遍后，加入蛋白洗脱液，将亲和层析柱于25℃摇动洗脱30分钟，过滤收集上清溶液；（8）使用超滤离心管将（7）中得到的上清溶液替换成NH₄HCO₃溶液；（9）将（8）中得到的溶液加入终浓度为10mM的二硫苏糖醇，于56℃保温30分钟后冷却到室温，接着加入终浓度为20mM的碘乙酰胺，于黑暗下25℃保温30分钟，接着加入胰蛋白酶，37℃保温5个小时，60℃烘干；（10）将得到的干粉样品在高效液相层析‑串联质谱中进行部分氨基酸残基测序分析；（11）将得到的氨基酸残基序列在链霉菌的全基因组数据库中进行序列比对，精确确定和目的DNA序列相结合的蛋白，及其对应的基因，并筛选出其中可能的调控基因；（12）体外表达并纯化筛选出的可能的调控蛋白，使用凝胶电泳进一步验证该蛋白与目的DNA相互结合的实验事实。