一种基于荧光蛋白分布比例的土壤内可利用氮素的检测方法

摘要

本发明的一种基于荧光蛋白分布比例的土壤内可利用氮素的检测方法，是由酿酒酵母菌株细胞自噬相关蛋白Atg8的荧光标记、土壤水萃液的获取、酿酒酵母在营养丰富培养基和不同氮素量培养基的培养、模型的建立和土壤内可利用氮素的推算等步骤组成，其特征在于：不同可利用氮素的量会使得GFP-Atg8在液泡内的分布比例不同，据此建立标准模型和推算未知土壤内可利用氮素的量。该方法操作简单、成本低廉、可真实反映生物对土壤内可利用氮素的响应情况。

主权项

一种基于荧光蛋白分布比例的土壤内可利用氮素的检测方法，其特征在于，该检测方法包括如下步骤：（1）以GFP对酿酒酵母菌株细胞中的自噬蛋白Atg8进行荧光标记；（2）土壤水萃液制备：收集1 g待测土壤，与10 mL去离子水在摇床上100 rpm振荡24 h得到土壤水萃液，然后高速离心5 min，取上清液，高温灭菌后备用；（3）氮素水平与GFP‑Atg8在液泡分布比例之间关系模型的建立： a.酵母细胞培养：将步骤（1）获得的酵母细胞在50 mL液体SD‑Ura培养基中培养至OD600 ≈ 1.0时，取30 mL培养液经离心、无菌水洗涤后转入不同氮素水平的液体培养基中，培养时间>2小时；b.对上述步骤a培养后的酵母细胞进行荧光观察，获得显微荧光照片，根据显微荧光照片的亮度和面积的信息，得到不同氮素水平下Atg8在液泡内的分布量；或者将步骤a培养后的酵母细胞收集，进行western‑blot，得到GFP‑Atg8降解的情况图，根据western‑blot结果，用亮度和面积信息与加样对照G6PDH所对应条带进行比较，得到归一化的GFP‑Atg8和Atg8的量的信息，计算Atg8进入液泡的情况；c.根据上述步骤b获得的液泡内Atg8的分布比例和不同的氮素水平，建立二者之间的关系模型；（4）测算样品的可利用氮素含量：以步骤（2）所获取的土壤水萃液作为唯一氮源，对步骤（1）荧光标记的酵母细胞进行培养，培养条件完全同步骤（3），得到显微荧光照片信息或western‑blot结果，计算得到Atg8在液泡内的分布比例；根据步骤c所建立的关系模型，计算所测试土壤样品的可利用氮素含量。