一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法

摘要

本发明公开了一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法，包括步骤：A）样本采集和细胞分离培养；B）传代培养：原代细胞经过培养，待细胞融合度达到80%以上，继续传代培养；C）生长曲线绘制；D）细胞检测：采用第三代细胞进行检测，准备消化好的第三代脐带间充质干细胞，缓冲液洗涤后对细胞进行抗体标记经孵育洗涤后，进行检测。本发明同时使用两种类型的胶原蛋白酶，透明质酸酶结合中性蛋白酶或accutase对脐带组织进行消化可以使得组织块快速充分的消化。

主权项

一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法，包括步骤：A）样本采集和细胞分离培养：A1）严格在无菌条件下采集产后足月胎儿的脐带组织，放入含有添加了80‑100U/ml青霉素和80‑100µg/ml链霉素培养基的无菌容器，0‑4℃运输，运输过程中确保脐带组织完全浸没在培养基溶液液面以下，48小时内对脐带组织进行处理；A2）将脐带中的胶体组织收集到离心管或培养皿中，用剪刀或组织破碎仪将胶体组织破碎成组织块；A3）量取胶体组织块到一个新的无菌器皿中，加入消化液在35‑37℃恒温振荡器中振荡孵育50‑80分钟，振荡频率为40‑60rpm；A4）向步骤A3)中消化后得到的混合液中加入1‑3倍体积的缓冲液稀释，充分混均后，转移并离心，弃上清液；A5）向沉淀中加入缓冲液洗涤细胞，再次离心，弃上清液；A6）向沉淀中加入生长培养基，充分吹打混匀后接种于贴壁培养皿中，放置培养箱中进行原代细胞培养，每二‑三天换培养液；B）传代培养：原代细胞经过培养，待细胞融合度达到80%以上，继续传代培养；C）生长曲线绘制：待第二代脐带间充质干细胞融合度达到80%以上，将细胞消化好，并终止消化，充分吹打混匀，离心弃上清液；用培养基重悬细胞后计数，将细胞悬液加入多孔板进行培养、检测；将检测结果绘制成脐带间充质干细胞生长曲线；D）细胞检测：采用第三代细胞进行检测，准备消化好的第三代代脐带间充质干细胞，缓冲液洗涤后对细胞进行抗体标记经孵育洗涤后，进行检测。