一种蜡样芽孢杆菌单克隆抗体制备方法及应用

摘要

本发明提供一种蜡样芽孢杆菌单克隆抗体制备方法及应用，包括以下步骤：1多聚甲醛固定制备菌抗原；2菌抗原注射免乳化；3短间隔脉冲注射快速促发免疫；4实体瘤种植复壮瘤细胞；5化学诱导融合；6半流体选择得单克隆杂交瘤；7阴阳性筛选配合得特异性抗体；8多抗作捕捉抗体，单抗作检测抗体组建双抗夹心ELISA。

主权项

一种蜡样芽孢杆菌单克隆抗体制备方法及应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)固定：使用一定浓度的多聚甲醛在合适的温度下孵育处理，使得蜡样芽孢杆菌的表面成分固定，得到的菌抗原的抗原决定簇与活菌的状态一致，然后离心洗涤，得到菌抗原；(2)免乳化：将固定好的蜡样芽孢杆菌的用生理盐水悬浮调至合适菌浓度，准备动物免疫；(3)短间隔脉冲免疫：选择六个外周免疫位点以肌肉注射方式，在短间隔脉冲免疫期内，将制备得到的细菌抗原悬浮液注射到免疫缺陷型小鼠体内；(4)实体瘤种植：将免疫缺陷型小鼠的骨髓瘤细胞制备细胞悬浮液，并以一定密度注射给小鼠，待一定期限后，出现有明显凸起的实体瘤；(5)细胞融合：选血清滴度高的小鼠供脾脏及淋巴结，制备脾脏及淋巴细胞混合悬浮液与一定比例的骨髓瘤细胞悬浮液混匀离心，扣干，在一定时间范围内加入一定浓度的化学诱导融合剂，在一定温度范围内静置孵育一定时间，加入不完全培养基终止反应；(6)半流体选择性培养：向含有选择性成分HAT的完全培养基添加一定质量的增稠剂使得培养基成为半流体状，将融合细胞均匀分散在半流体培养基，于二氧化碳细胞培养箱培养；(7)消减筛选：将获得杂交瘤细胞上清，首先进行一定轮数的阳性筛选，然后进行相应轮数的阴性筛选，得到的杂交瘤细胞即为所取；(8)双抗夹心ELISA：以合适浓度的抗蜡样芽孢杆菌的兔多克隆抗体包被到固相载体上作为捕获抗体以合适稀释度的单克隆抗体为检测抗体，借助酶标二抗建立双抗夹心ELISA检测方法；(9)试剂盒：将ELISA各组分抗体、洗涤液、标准品等装填入玻璃瓶及塑料瓶，选取合适固相载体，进行预包被、双封闭剂封闭，干燥后装入试剂盒。