重组KLK14蛋白的纯化方法

摘要

本发明公开了一种重组KLK14蛋白的亲和层析纯化方法，包括步骤：(1)将重组SPINK6蛋白与亲和层析介质混合，偶联反应，制得重组SPINK6蛋白亲和层析介质；(2)将重组KLK14蛋白通过预先用缓冲液A平衡好的装有步骤(1)的SPINK6蛋白亲和层析介质的层析柱；然后用缓冲液A清洗上样后的重组SPINK6蛋白亲和层析柱；再用缓冲液B将重组KLK14蛋白从层析柱上洗脱，并收集洗脱峰。本发明方法获得的重组KLK14蛋白的活性回收率为50-65％，纯度可达85％-90％，蛋白纯化倍数为10-20倍以上。本发明方法处理速度快、重复性好、柱效长且结合效率基本不变。

主权项

重组KLK14蛋白的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：亲和介质：偶联有SPINK6蛋白的Sepharose4B凝胶3ml，购自Pharmacia生物技术有限公司，经CNBr活化，预先装入10ml容积层析柱；样品：人重组KLK14蛋白样品为含有编码人重组KLK14蛋白的基因的毕氏酵母发酵上清液经离子交换步骤纯化后的40ml洗脱峰与平衡缓冲液以体积比1:1混合而成的80ml样品缓冲液，所述洗脱峰中KLK14蛋白含量为0.003mg/ml，纯度为25%；层析设备：AKTA explorer 100蛋白纯化系统，购自GE生物技术公司；平衡、清洗缓冲液：含0.05mol/L NaCl的0.01mol/L Tris‑HCl pH7.5缓冲液；洗脱缓冲液：0.1mol/L Gly‑HCl pH3.0缓冲液；中和缓冲液：1mol/L Tris‑HCl pH7.5缓冲液；平衡：用平衡缓冲液平衡装有3ml偶联有胰蛋白酶的Sepharose4B凝胶层析柱，柱高为3.5cm，以70cm/h流速平衡5个柱体积，通过紫外检测A280保证层析柱已平衡至基线；上样：将80ml样品缓冲液以70cm/h通过经平衡缓冲液平衡好的胰蛋白酶的Sepharose4B凝胶层析柱,待紫外检测变化时开始收集流穿峰；清洗：上样完，用清洗缓冲液以50cm/h的流速清洗层析柱，用量为层析柱体积的5倍，待紫外检测A280至基线时停止收集流穿峰，共收得107ml流穿液；洗脱：清洗至基线后，用洗脱缓冲液以30cm/h的流速将重组KLK14蛋白从层析柱上洗脱下来，待紫外检测变化时开始收集洗脱峰，缓冲液用量为层析柱柱体积的4倍，在洗脱液收集管中预先加入中和缓冲液，收集洗脱峰3毫升，其中峰1为重组KLK14蛋白洗脱峰，峰2为重组KLK14蛋白流穿峰。