一种黄曲霉素B1快速检测试纸条及其制备方法与应用

摘要

一种黄曲霉素B1快速检测试纸条及其制备方法与应用，本发明之黄曲霉素B1快速检测试纸条，由以下方法制备而成：（1）抗黄曲霉素B1单抗的制备和纯化；（2）胶体金溶液的制备；（3）胶体金标记抗体；（4）喷金；（5）硝酸纤维素膜上包被C,T线；（6）黄曲霉素B1胶体金免疫层析快速检测试纸条的组装。本发明还包括所述黄曲霉素B1快速检测试纸条的应用。本发明之黄曲霉素B1快速检测试纸条，可大规模地对粮食及其加工产品黄曲霉素毒素进行快速、方便的检测。

主权项

一种黄曲霉素B1快速检测试纸条，其特征在于，按照以下方法制备而成：（1）抗黄曲霉素B1单抗的制备和纯化:用黄曲霉素B1偶联牛血清蛋白，混合弗氏不完全佐剂免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出稳定分泌抗黄曲霉素B1单克隆抗体的阳性细胞株并扩大培养，注射细胞进小鼠体内诱生腹水；取2‑4 ml黄曲霉素B1腹水，加入相当于腹水体积1.8－2.2倍的摩尔浓度为 0.03‑0.08 mol/L的pH 4.5‑5.5的乙酸缓冲液，用摩尔浓度为0.08‑0.12mol/L的HCl调pH 至4.0‑5.0，于室温搅拌下逐滴加入辛酸，所述辛酸的加入量为每毫升稀释前的腹水加入30－40μl辛酸，搅拌20‑40min，2‑8℃静置1‑2h，然后在2‑8℃下，在8000‑12000r/min转速下离心20‑40min，取上清液；上清液经砂芯漏斗过滤后加入相当于上清液体积1/20‑1/5的pH为7.0‑7.5的磷酸盐缓冲液，在2‑8℃冷水浴下加入硫酸铵，使硫酸铵的终浓度为0.25‑0.30 g/ml，静置1‑2h，2‑8℃、8000‑12000r/min离心10‑20min，弃上清液，将沉淀溶于摩尔浓度为0.008‑0.012mol/L的PBS溶液中进行透析：2‑8℃静置过夜，8000‑12000r/min离心10‑20min，弃沉淀；得上清液抗黄曲霉素B1单抗；（2）胶体金溶液的制备：取质量浓度为0.008‑0.012%的氯金酸水溶液100ml，搅拌加热至沸腾，一次性快速加入质量浓度为0.8‑1.2%的柠檬酸三钠水溶液2.0－2.5ml，继续搅拌加热0.5‑24h，直至溶液呈酒红色，室温冷却，得到含有粒径为20－40nm的胶体金颗粒的胶体金溶液,胶体金溶液4℃保存；（3）胶体金标记抗体：取步骤（2）所得胶体金溶液90－110ml，用摩尔浓度为0.2－0.3mol/L的碳酸钾溶液将其pH值调至8.0－8.5；将步骤（1）所得抗黄曲霉素B1单抗1.6mg加入到胶体金溶液中，搅拌均匀，静置0.5－24小时；逐滴加入质量浓度为8－12%的无菌牛血清蛋白10－12ml，搅拌0.5－24h，4℃－30℃静置过夜；将标记后的胶体金溶液于12000－14000r/min离心30－50min，弃上清液，往所得沉淀中加入摩尔浓度为0.01－0.02mol/L的磷酸盐缓冲液3－5ml重悬，得到抗黄曲霉素B1单抗标记的胶体金溶液；（4）喷金：将步骤（3）所得抗黄曲霉素B1单抗标记的胶体金溶液按2－10μl/cm的喷量喷在结合垫上，37℃－45℃抽风烘干，时间为5－24h，得到喷金后的结合垫；（5）硝酸纤维素膜上包被C,T线：在硝酸纤维素膜上包被C线和T线，其中C线为质控线，包被羊抗鼠免疫球蛋白G，浓度为0.2－1.5mg/ml；T线为检测线，包被偶联抗原黄曲霉素B1偶联牛血清蛋白，浓度为0.2‑0.5mg/ml；37℃－45℃抽风烘干，时间为2－24h；得到包被后的硝酸纤维素膜；（6）黄曲霉素B1胶体金免疫层析快速检测试纸条的组装：将聚氯乙烯底板、样品垫、步骤（4）所得喷金后的结合垫、步骤（5）所得包被后的硝酸纤维素膜和吸水纸组装，切割成条，得到黄曲霉素B1胶体金免疫层析快速检测试纸条；组装方式如下：以聚氯乙烯为底部支撑，将样品垫，喷金后的结合垫、包被后的硝酸纤维素膜和吸水纸以依次连接的方式粘贴在聚氯乙烯底板上制成；其中样品垫和吸水纸位于两端，包被后的硝酸纤维素膜的两端分别位于结合垫和吸水纸的下面，结合垫的一端设置于样品垫的下面，另一端设置于包被后的硝酸纤维素膜的上面；所述包被后的硝酸纤维素膜上设置检测T线和质控C线，其中检测线T线靠近样品垫一端；所述结合垫和样品垫是将聚酯膜经过混合液浸泡5－24h，取出后于37－45℃抽风烘干得到；所述混合液为摩尔浓度为0.01－0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，质量体积比为3g－6g/100ml磷酸盐缓冲液的非离子表面活性剂，所述非离子表面活性剂为脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚或脂肪酸聚乙二醇酯、体积比为1ml－4ml/100ml磷酸盐缓冲液的吐温20和质量体积比为5g－20g/100ml磷酸盐缓冲液的聚乙二醇6000组成的，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.0－7.5。