可同时检测副溶血弧菌和创伤弧菌的双重LAMP方法

摘要

本发明公开了一种双重LAMP检测方法，该方法可同时检测副溶血弧菌和创伤弧菌。属于分子生物学技术领域。所述LAMP检测体系中含有检测副溶血弧菌基因OmpA和创伤弧菌metalloprotease基因的引物组，该引物组分别包含OmpA基因和etalloprotease基因的一对外引物F3、B3和一对内引物FIP、BIP；内引物BIP上分别含有PstI和BamHI酶切位点。该发明方法灵敏度高，特异型好，操作简单，结果观察直观明了，检测速度快。

主权项

可同时检测创伤弧菌和副溶血弧菌的双重LAMP检测方法，其特征在于包括下述步骤：(1)根据GeneBank中已知创伤弧菌metalloprotease基因(GenBank accession no::U50548.1)和副溶血弧菌ompA基因(GenBank accession no::JTGT01000603.1)作为靶序列，通过Primer Explore V4在线设计软件设计四条特异性引物,对于V.vulnificus，在BIP的B1c和B2之间添加BamHI酶切位点，在FIP的F1c和F2之间添加‑TTTT‑连接子；对于V.parahaemolyticus，在BIP的B1c和B2之间添加PstI酶切位点，在FIP的F1c和F2之间添加‑TTTT‑连接子，设计以下两组LAMP引物：(2)配制LAMP反应体系反应体系的终浓度为：总体系25μl,包括Bst DNA聚合酶1μl(8U)，10×BstDNA Buffer2.5μl，PCR级甜菜碱4μl(5M)，dNTPs(2.5mM each)2.5μl,DNA模版1μl，FIP/BIP各1μl(0.8μM)，F3/B3各1μl(0.2μM)，加双蒸水使反应体系总体积达到25μl；(3)LAMP反应体系扩增：将上述反应体系进行扩增反应，反应温度58℃到65℃，反应时间为45min到90min；(4)扩增产物检测：2％琼脂糖凝胶电泳；产物加入SYBR Green I，观察反应管中颜色变化。