一种基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法

摘要

本发明公开了一种基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，该方法首先将滚环扩增引物固定到芯片上成微阵列，然后用β-葡萄糖基转移酶处理待检测基因组DNA，将基因组DNA中所有5hmC进行糖基化修饰，再用亚硫酸钠处理修饰后DNA，然后将检测不同C位点的开环探针置于同一反应管中进行杂交连接；再将连接后产物同芯片杂交，固定芯片的特异引物以连接探针为模板进行滚环扩增，最后不同荧光检测探针同芯片杂交：根据芯片不同矩阵点荧光的类型和强弱，判断出基因组DNA不同C位点是否发生了羟甲基化及其频率大小。该方法可操作性强，特异性强，灵敏度高，检测结果准确，检测效率高，且检测成本低，应用范围广泛。

主权项

一种基于芯片的高通量高灵敏检测5‑羟甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)首先将滚环扩增引物固定到芯片上成微阵列；(2)然后用β‑葡萄糖基转移酶处理待检测基因组DNA，将待检测基因组DNA中所有5‑羟甲基化胞嘧啶进行糖基化修饰，再用亚硫酸钠处理糖基化修饰后的DNA，DNA中所有未发生羟甲基化胞嘧啶C反转成尿嘧啶U，而糖基化修饰5‑羟甲基化胞嘧啶不被反转；然后将检测不同C位点的开环探针I和开环探针II放置于同一反应管中，并进行杂交连接，若特定C位点发生羟甲基化，则开环探针I能连接成环；若未发生羟甲基化，则开环探针II能连接成环；(3)再将步骤(2)连接成环后产物同步骤(1)芯片杂交，固定芯片的滚环扩增引物以连接成环后产物为模板进行滚环扩增；然后采用不同荧光检测探针同芯片杂交，根据芯片不同矩阵点荧光的类型和强弱，检测出待测基因组DNA中不同C位点是否发生了羟甲基化及其频率大小，从而实现快速检测待测基因组DNA中5‑羟甲基化胞嘧啶；步骤(1)所述的滚环扩增引物长23bp，其包括5’端8个T和3’端15bp，近3’端15bp与开环探针I或开环探针II的5’端的15bp序列互补；所述芯片是普通玻璃片或是微球，其表面是聚丙烯酰胺修饰；被固定的扩增引物5’端为丙烯酰胺基团修饰；步骤(2)所述的开环探针I和开环探针II均为合成的寡核苷酸，开环探针I和开环探针II均由4部分组成，分别包括30bp的C位点检测部分、17bp的通用荧光检测探针杂交部分、15bp的通用扩增引物杂交部分以及5bp的连接序列部分；其中开环探针I和开环探针II的C位点检测部分和通用荧光检测探针杂交部分不同，而通用扩增引物杂交部分和连接序列部分的序列长度和组成均相同；步骤(2)所述的连接成环是指开环探针I或开环探针II分别与对应的C位点所在序列互补配对后，开环探针I或开环探针II的5’和3’端在连接酶作用下被连接起来；步骤(3)所述的滚换扩增，是指连接成环的探针与芯片固定的滚环扩增引物杂交后，扩增引物以连接成环的探针为模板进行引物延伸反应；步骤(3)所述的不同荧光检测探针是指若C位点碱基为C或mC则荧光探针为Cy3标记，若C位点碱基为hmC则荧光探针为Cy5标记。