一种肺癌患者血清特异性代谢产物谱及其建立方法

摘要

本发明公开了一种肺癌患者血清特异性代谢产物谱及其建立方法，具体是基于肺癌患者的血清进行液相/气相色谱质谱联用代谢组学分析方法，包括：收集健康正常体检者和肺癌患者手术前及术后7天空腹血标本，经处理后经色谱柱分离，并采用质谱检测分析后提取并对齐仪器原始数据，采用多变量数据统计软件建立数学模型对上述代谢物谱进行分析，比较正常人与肺癌患者代谢物谱的差异，从而确定特异性代谢物谱。本发明方法可以全面、综合地体现肺癌患者的代谢产物的变异状况，可用于肺癌的早期诊断或为预后提供有利的技术支持。

主权项

一种基于肺癌患者血清的液相/气相色谱质谱联用代谢组学分析方法，包括：(1)样品制备：收集临床病人与正常人的血清样本，具体为：收集健康正常体检者和肺癌患者手术前及术后7天空腹血标本各5mL于无菌促凝BD真空采血管中，2500rpm，4℃离心5min，取上层血清，保存于‑80℃冰箱中待用；进行液相色谱质谱测定样本的处理为：将低温保存的血清样本置室温解冻摇匀，取100μL的样本加入300μL甲醇，涡漩震荡30s，4℃静置20min；所有样本进行12000rpm，4℃，15min冷冻离心，取200μL上清液，转入进样小瓶备用；进行气相色谱质谱测定样本的处理为：将低温保存的血清样本置室温解冻摇匀，取100μL的样本加入300μL甲醇，涡漩震荡30s，4℃静置20min；所有样本进行12000rpm，4℃，15min冷冻离心，取150μL上清液，转入玻璃衍生小瓶，加入10μL的浓度为0.02mg/mL的二氯苯丙氨酸内标溶液，置温和氮气下吹干4℃；向玻璃衍生小瓶中加入30μL的20mg/mL甲氧胺盐酸吡啶溶液，强烈震荡30s，于37℃肟化反应90min；取出后加入30μL的含1％TMCS BSTFA的衍生试剂，于70℃反应60min，取出样本，室温放置30min，转入进样小瓶备用，准备进行色谱检测分析；(2)液相色谱质谱和气相色谱质谱分析测定：采用基于液相色谱质谱和气相色谱质谱的方法得到血清中的代谢物谱，并对代谢物谱进行分析；代谢物谱经过处理得到原始数据，所述原始数据是各个峰的峰高或者峰面积以及质量数和保留时间数据；对原始数据进行峰检测和峰匹配：采用R软件平台下采用自写的程序代码进行所述峰检测和峰匹配；(3)模式识别分析血清中代谢物谱：上述数据采用多变量数据统计软件建立数学模型，对步骤(2)中产生的代谢物谱进行分析，比较正常人与肺癌患者代 谢物谱的差异，从而确定特异性代谢物谱；所述步骤(3)中的多变量数据统计软件Simca‑P11.0，选用主成分分析PCA、偏最小二乘方判别分析PLS‑DA、正交偏最小二乘方分析OPLS的方法建立数学模型，比较正常人与肺癌患者手术前后代谢物谱的差异，从而确定特异性代谢物谱；所述步骤(2)中液相色谱‑质谱条件为：Agilent C18色谱柱，色谱柱为100mm×2.1mm、1.8μm，流速0.4mL/min，柱温为40℃，流动相A：0.1％甲酸‑水，B：0.1％甲酸‑乙腈，进样量为4μL，自动进样器温度4℃；ESI离子源，采用正离子扫描模式，以氮气作为雾化、锥孔气；毛细管电压4kV、锥孔电压35kV、离子源温度100℃；脱溶剂气温度350℃、反向锥孔气流50L/h、脱溶剂气600L/h、萃取锥孔4V；离子扫描时间0.03s，扫描时间间隔0.02s，数据采集范围：50‑1000m/z；所述步骤(2)中气相色谱‑质谱条件为：毛细管色谱柱为Agilent J&W Scientific公司的HP‑5ms，色谱柱为30m×0.25mm×0.25μm，仪器参数设定为：进样口温度280℃，EI离子源温度230℃，四极杆温度150℃，纯度大于99.999％的高纯氦气作为载气，不分流进样，进样量1.0μL；升温程序为：初始温度80℃，维持2min，10℃/min的速度升至320℃，并维持6min；采用全扫描模式进行质谱检测，质谱检测范围为50‑550m/z；所述步骤(2)中采用Agilent MassHunter工作站Qualitative Analysis VB03.01,Agilent,USA，记录每个血清样本的总离子流色谱图TIC进行可视化检查，在R软件平台下采用自写的程序代码提取峰识别和积分原始数据信号，然后进行保留时间校正、峰对齐和反卷积分析质谱碎片归属，最后在Excel软件中进行后期编辑，将结果组织为二维数据矩阵，包括保留时间Rt以及质荷比m/z、样 本观察量和积分面积。