一种利于七次跨膜蛋白CCR5功能性表达的方法

摘要

本发明涉及一种利于七次跨膜蛋白CCR5功能性表达的方法，其步骤如下：（1）将CCR5外源DNA模版经编码修饰后，插入到载体上，直接添加到无细胞表达体系中，通过添加DNA转录翻译以及蛋白质表达所必需的氨基酸、能量物质、T7聚合酶和表面活性剂，优化实验条件，来实现蛋白质的体外表达。（2）由于在步骤（1）表达CCR5时，膜蛋白易产生聚集形成包涵体或者产生错误折叠的现象，所以在步骤（1）的同时，加入相对应的分子伴侣，为目标蛋白质的正确折叠提供封闭的疏水环境，使所表达的CCR5能够充分的正确折叠，并且提高膜蛋白的可溶性表达量。本发明中CCR5制备设备工艺简单，适合跨膜蛋白质的快速和高通量表达，活性也得到很好得改善。

主权项

一种利于七次跨膜蛋白CCR5功能性表达的方法，其特征在于：其步骤如下：(1)表达基因的制备：将CCR5的编码DNA在C端接入6×His‑tagged，并且插入到pIVEX2.3d载体序列中。(2)七次跨膜蛋白的表达：将步骤(1)得到的载体基因，连同蛋白表达必需的无细胞表达体系：大肠杆菌提取物、反应缓冲液、去甲硫氨酸氨基酸以及甲硫氨酸、T7聚合酶、表面活性剂和分子伴侣混合，按一定体积，置于反应容器中，并在33℃条件下，于恒温摇床培养3.5h。(3)在步骤(2)反应开始30min后，再加入与步骤(2)等体积的补给缓冲液、氨基酸和甲硫氨酸的混合液，作为养料补充，使其能够充分表达折叠。