检测葫芦科种子携带黄瓜绿斑驳花叶病毒的样品制备方法及用途

摘要

本发明公开了检测葫芦科种子携带黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)的样品制备方法及用途。本发明从处理种子样品入手，将葫芦科种子进行壳、仁分离处理，去除含毒量较低的种仁部分，留下含毒量较高的种壳部分作为待测样品，借助全自动样品快速研磨仪将经过处理的种子样品充分研磨，研磨充分的样品既可以通过RT-PCR方法，也可以通过斑点酶联免疫吸附法(dot-ELISA)快速检测大量葫芦科种子中的CGMMV。本发明适用于葫芦、黄瓜、瓢瓜、南瓜、长瓜、西瓜等常见的葫芦科种子的带毒检测。该发明检测方法灵敏度高、特异性好、耗时短、成本低，为葫芦科种子携带黄瓜绿斑驳病毒病的大规模检测及科学防控提供技术支撑，并为其他种子传植物病毒的检测提供借鉴。

主权项

一种检测葫芦科种子携带黄瓜绿斑驳花叶病毒的样品制备方法，其特征在于包括如下步骤：1)种子样品种仁和种壳的分离：将每颗葫芦科种子用眼科剪刀沿侧面剖开，剥除种仁部分，收集剩余的种壳；2)样品的研磨：以1粒种子分离的种壳作为1个样品放入已放3‑5颗直径2.5mm实心钢珠的1.5‑2ml eppendorf离心管中，盖上离心管盖子，在离心管上做好标记后将其丢入液氮中冷冻处理1分钟后捞出，然后放入上海净信实业发展有限公司货号为Tissuelyser‑48的全自动样品快速研磨仪中以频率60HZ研磨60秒，使样品呈粉末状，如果样品没有呈粉末状可重复研磨一次；3)黄瓜绿斑驳花叶病毒的粗提取：研磨好的样品中加入0.1‑1mlpH7.40.01mol/L PBS磷酸盐缓冲液，在Scientific Industries公司的VortexGenie2涡旋混合器上混匀0.5‑5分钟，然后5000rpm离心3分钟后取上清液作为黄瓜绿斑驳花叶病毒的粗提取液进行血清学方法检测黄瓜绿斑驳花叶病毒；或黄瓜绿斑驳花叶病毒RNA的提取：研磨好的样品中加入1mlTRIzol试剂后用常规TRIzol试剂法提取病毒RNA，提取的病毒RNA用于黄瓜绿斑驳花叶病毒的分子检测。