食品中创伤弧菌和溶藻弧菌的PCR检测方法

摘要

一种食品中创伤弧菌和溶藻弧菌的PCR检测方法，其特征在于：其检测步骤为：待检测的样品经二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因组DNA，然后经PCR反应后，再经电泳、染色、漂洗，最后用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分析即可得出检测结果。本发明的优点在于：可同时检测食品中的创伤弧菌和溶藻弧菌，可以在不影响检出率的条件下加快检测速度，减少工作量和检测成本。

主权项

1.一种食品中创伤弧菌和溶藻弧菌的PCR检测方法，其特征在于：其检测步骤为：(1)待检测的样品二次增菌：所述的二次增菌，包括第一次增菌和第二次增菌，所述的第一次增菌，其操作步骤为：在无菌条件下，取充分剪碎的样品，加入盛有3％的NaCl碱性蛋白胨水的灭菌容器内，所述样品与碱性蛋白胨水的用量为：每25克样品加入225ml的碱性蛋白胨水，在37℃±3℃条件下培养4h～15h，所述的第二次增菌，其操作步骤为：吸取一定量第一次增菌的增菌液加入盛有3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内，所述增菌液与碱性蛋白胨水的用量为：每1ml增菌液加入9ml的碱性蛋白胨水，在37℃±3℃条件下培养4h～15h；(2)水煮法提取弧菌基因组DNA：取培养的菌液加入离心管中，以13000rpm离心1min，弃上清液，然后加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀，振荡混匀后，96-100℃水浴10min，12000rpm离心5min，取上清液作为DNA模板，-20℃环境下储存备用；(3)PCR反应：所述的PCR反应为二重PCR反应，其反应体系为：H2O：13.1μl，Buffer：2.6μl，dNTP：0.5μl，P：(0.4*4)μl，Taq酶：0.2μl，模板DNA：2.0μl，总体积为20μl；所述的PCR反应循环参数为：94℃预变性3min；然后94℃变性1min，60℃退火1min，72℃复性1min循环35次，最后72℃延伸7min；(4)电泳：所述的电泳为琼脂糖凝胶电泳，其操作步骤为：PCR反应结束后以98V电压2.5％凝胶电泳90min；(5)染色：所述的染色为在溴化乙锭溶液中染色20min；(6)漂洗；(7)用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分析即可得出检测结果：所述的谱图分析包括阳性对照和阴性对照，对于谱图中是否有相应特征位置条带的出现，即可判别被检测对象中是否有创伤弧菌和溶藻弧菌的存在。