一种邻苯二甲酸二异辛酯人工抗原的制备方法

摘要

一种邻苯二甲酸二异辛酯人工抗原的制备方法，属于生物化工技术领域。本发明以4－硝基邻苯二甲酸为原料，在浓硫酸的催化下与异辛醇发生酯化反应，然后利用铁粉还原法使4－硝基邻苯二甲酸二异辛酯苯环上的硝基还原为胺基，制备半抗原；利用重氮化法对半抗原上的胺基进行重氮化并使之与牛血清蛋白结合，制备邻苯二甲酸二异辛酯的人工抗原，即邻苯二甲酸二异辛酯－牛血清蛋白。本发明合成了邻苯二甲酸二异辛酯的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析，为以后的研究提供了方便，可满足国内对其研究的需要。

主权项

1.一种邻苯二甲酸二异辛酯人工抗原的制备方法，其特征是以4-硝基邻苯二甲酸为原料，在浓硫酸的催化下与异辛醇发生酯化反应，然后利用铁粉还原法使4-硝基邻苯二甲酸二异辛酯苯环上的硝基还原为胺基，制备人工半抗原；利用重氮化法对半抗原上的胺基进行重氮化并使之与牛血清蛋白结合，制备邻苯二甲酸二异辛酯的人工抗原，即邻苯二甲酸二异辛酯-牛血清蛋白；步骤为：(1)人工半抗原的制备：①4-硝基邻苯二甲酸二异辛酯的合成称取0.12mol的4-硝基邻苯二甲酸于100mL的三颈烧瓶中，加入0.1mol即15.74mL的异辛醇，加入一定量的苯助溶，在搅拌的条件下，缓慢加入1.6mL的浓硫酸，加热升温至110-130℃，反应7-24h，减压蒸去有机溶剂，油状残留加入到冷水中用质量浓度10％的Na2CO3溶液洗至下层水层无色，取上层得到暗红色的油状粗品，用无水乙醇进行重结晶，得到43mmol的4-硝基邻苯二甲酸二异辛酯；薄层层析法检测：硅胶薄板下端1cm处作一水平线，吸取反应液1μL点于线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为乙酸∶正己烷体积比为1∶15，展开至薄板3/4处，取板，吹干溶剂；将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察，在Rf为0.76处观察到显色点作为反应终点；②4-氨基邻苯二甲酸二异辛酯的合成称取9mmol还原铁粉于50mL圆底烧瓶中，加入10mL水、3mmol氯化铵，水浴中加热15min；另称取4-硝基邻苯二甲酸二异辛酯3mmol，用一定量的甲醇溶解后，分3次加入上述的反应液当中，回流反应4-6h；趁热过滤铁粉，将滤液进行减压蒸馏，得到的橙红色残留用少量热甲醇溶液溶解，4℃析出1.06g橘红色油状液体的4-氨基邻苯二甲酸二异辛酯作为半抗原备用；薄层层析法检测：硅胶薄板下端1cm处作一水平线，吸取反应液1μL点于线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为乙酸∶正己烷体积比为1∶15，展开至薄板3/4处，取板，吹干溶剂；将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察，在Rf为0.52处观察到显色点作为反应终点；(2)人工抗原的制备：制备A液：称取5mg半抗原于25mL烧杯中，加入1mL二甲基甲酰胺、0.1mL水和0.1mL的1M盐酸，形成黄色溶液，冷却至4℃，然后逐滴滴加1M亚硝酸钠溶液，用淀粉碘化钾试纸监测，直到试纸变蓝灰色停止滴加，4℃下搅拌1h，此液为A液；制备B液：称取10mg牛血清蛋白溶于1.5mL的pH9.0硼酸盐缓冲液，4℃保存，此液为B液；在4℃搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液中，并用1N的氢氧化钠溶液调节pH，使pH保持在9；在4℃条件下搅拌保存过夜，得人工抗原混合液；透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.05M的碳酸氢钠溶液和2×2L的去离子水透析4-6天，使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：邻苯二甲酸二异辛酯-牛血清蛋白。(3)人工抗原的鉴定：邻苯二甲酸二异辛酯-牛血清蛋白采用紫外扫描测定其偶联比，在吸收波长310nm处测吸光值，并计算其偶联比。