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Método de ensayo de detección para un procedimiento de PCR que utiliza FRET, comprendiendo el método las etapas de proporcionar una primera secuencia oligonucleótida de marcaje único y por lo menos una segunda secuencia oligonucleótida de marcaje único, siendo la primera y segunda secuencias oligonucleótidas de diferente Tm, en donde la primera y segunda secuencias oligonucleótidas se hibridan entre sí en solución libre, formando una pareja fluorescente desactivada, proporcionado por lo menos un cebador e iniciando la PCR, generando de esta manera una secuencia complementaria a una o a ambas secuencias, presentando una de entre la primera y segunda secuencias oligonucleótidas una Tm inferior a la Ta del procedimiento de PCR, caracterizado porque la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único consiste de una secuencia oligonucleótida que presenta un único marcaje en un extremo, comprendiendo el cebador o cebadores por lo menos un cebador con cola no marcado, presentando el cebador con cola no marcado una región de cola, comprendiendo la región de cola una secuencia oligonucleótida idéntica a una secuencia oligonucleótida de la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único, siendo la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único un cebador a partir del que se inicia la síntesis de ADN tras generarse una secuencia complementaria a la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único durante el procedimiento de PCR, de manera que la segunda secuencia oligonucleótida de marcaje único ya no puede hibridarse con la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único, generando una señal medible.
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