一种条斑紫菜微卫星标记的筛选方法及其应用

摘要

本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及一种条斑紫菜微卫星标记的筛选方法，及利用这些标记进行种质资源遗传多样性分析的方法，从而为条斑紫菜的遗传结构分析、种质资源保护及分子标记辅助育种奠定基础。

主权项

1、一种条斑紫菜微卫星标记的筛选方法，包括以下步骤：(1)提取条斑紫菜丝状体基因组DNA，利用限制性内切酶Hae III和Afa I对基因组DNA进行酶切，电泳检测回收500-1500bp大小的片段；将所述的片段与5’端磷酸化的接头连接，以上述连接产物为模板，以接头中的短链为引物，利用PCR方法进行富集；所述的接头序列第一链为5’TAGTCCGAATTCAAGCAAGAGCACA3’，第二链为5’CTCTTGCTTGAATTCGGACTA3’；所述的短链序列为5’CTCTTGCTTGAATTCGGACTA3’；(2)利用生物素标记的(GA)15为探针与上述PCR富集产物进行杂交，在离心管内用平衡过的Streptavidin Magnesphere磁珠对上述杂交混合物进行吸附，吸附后将离心管置于磁力架上，去除杂交液，对磁珠进行洗涤，洗脱未结合到磁珠上的DNA片段；将洗涤后的磁珠悬浮于TE溶液中，于94-96℃变性，使含有微卫星序列的DNA片段脱离磁珠，迅速收集上清，离心得到含有微卫星序列的DNA片段；以离心得到的DNA片段为模板，以上述接头中的短链为引物，通过PCR方法进行富集，构建含有微卫星序列的富集文库；(3)以含有15次GA重复的寡核苷酸序列为探针，采用菌落原位杂交的方法筛选阳性克隆；将菌落原位杂交获得的阳性克隆进行测序，筛选微卫星序列，对含有重复单元的序列进行分析，设计引物序列，获得微卫星标记。