一种定量测定作物种子脂肪氧化酶活性的方法

摘要

本发明属于生物化学领域，涉及一种对作物种子中脂肪氧化酶活性进行单粒、定量测定的方法。包括提取粗酶、亚油酸底物溶液的配制、淀粉液的配制、碘化钾溶液的配制、柠檬酸溶液配制、粗酶活性的测定六个步骤。本发明具有可用单粒种子测定、使用设备简单、操作简便、测量迅速、通量高、测定结果准确等优点。

主权项

1.一种定量测定作物种子脂肪氧化酶活性的方法，其特征是包括以下步骤：(1)、提取粗酶：取单粒作物种子，磨粉后加入0.6～3.0ml PH6.0～7.0磷酸缓冲液，于0℃静置1小时，其间振荡2次，每次30秒，12000转/分钟离心10分钟，4℃，上清液过三层粗棉布即得粗酶液，立即放入-20℃保存，采用考马斯亮蓝法测定提取液中可溶性蛋白的含量，标准曲线由浓度为10-60μg/ml的牛血清蛋白建立；(2)、配制亚油酸底物溶液：于800μl蒸馏水中加入15.6μl吐温20，15.6μl亚油酸，摇匀后加入100μl、1M的NaOH，加蒸馏水定容至5ml；(3)、配制淀粉溶液：于1.0克可溶性淀粉中加入100ml蒸馏水，沸水浴中加热直到溶液透明，冷却后使用；(4)、配制碘化钾溶液：称取1.5克KI，加入1.0ml蒸馏水，缓慢加热，冷却后有KI沉淀；(5)、配制柠檬酸溶液：称取52.5克柠檬酸，加入蒸馏水定容至250ml；(6)、粗酶活性的测定：取0.1ml粗酶提取液，加入0.2ml亚油酸底物溶液，摇匀后再加入0.1ml淀粉液、0.2ml碘化钾液和2.4ml柠檬酸液，30℃静置5分钟后测定470nm处的吸光值；另取0.1ml粗酶提取液作为空白对照，在沸水浴中煮10分钟后，加入0.2ml亚油酸底物溶液，摇匀后再加入0.1ml淀粉液，0.2ml碘化钾液和2.4ml柠檬酸液，30℃静置5分钟后测定470nm处的吸光值；在上述反应条件下，将每分钟催化每毫克总蛋白所需的酶量定义为1个活力单位U，由此得出酶活力计算公式为：U＝(吸光值×1000)/(蛋白质含量mg×时间min)。