重组鸡-β防御素蛋白Gal-9的制备方法

摘要

本发明提供的是一种重组鸡-β防御素蛋白Gal-9的制备方法。本发明用分子生物学技术，从鸡体内克隆到鸡-β防御素Gal-9基因，选用合适的表达宿主在体外表达鸡-β防御素Gal-9蛋白。进一步研究发现，鸡-β防御素Gal-9蛋白具有广谱抗菌活性和免疫促进作用。采用本发明的方法得到的重组鸡Gal-9蛋白：1)能抑杀大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等菌，2)抗鸡传染性支气管炎病毒，3)经鸡口服后1周后，提高免疫鸡血清中抗鸡传染性支气管炎病毒抗体水平10-20％，提高鸡脾淋巴细胞转化率40-50％。

主权项

1、一种重组鸡-β防御素蛋白Gal-9的制备方法，其特征是：(1)根据已发表的鸡-β防御素Gal-9基因序列设计特异性引物，上游引物：5’-GGA TCC CCG GAA TTC ATG CAG ATC CTG CCT CTC-3’，下游引物：5`-TCA GGA ATA CCA TCG GCT CCG GCA GCA GAA-3`；(2)采用RT-PCR方法从鸡舌组织中扩增鸡β防御素Gal-9基因并克隆到PMD-T载体上，经序列测定得如下基因序列：AAGCTTGGGAATCTCTAAGGATCCCCGGGTACGGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCCGCTCACAATTCCACACAACATACC其中：阴影部分为目标基因，方框内为引物，斜体分别为起始密码子与终止密码子；(3)根据鸡-β防御素Gal-9基因序列特点，用EcoRI和SalI双酶切位点将Gal-9基因亚克隆到原核表达载体PGEX-6p-1中，构建重组表达载体PGEX-6p-1-Gal-9，将其转化大肠杆菌BL21感受态细胞，Amp+筛选阳性克隆；(4)含阳性重组质粒的大肠杆菌BL21单个菌落在Amp+LB培养基中37℃振荡培养，待OD值达到0.3-0.5时加入IPTG、终浓度为0.6mM进行诱导，诱导4小时后采1ml菌样，并于4℃、5000转离心5分钟，收获细菌沉淀，在沉淀中加入1/10菌液体积的1×SDS凝胶上样缓冲液，煮沸5分钟，冰浴2分钟，进行SDS-PAGE分析鉴定，取处理过的样品15ul/孔，进行SDS-PAGE电泳，积层胶浓度为5％，分离胶为12％，电泳后，经考马斯亮蓝染色，甲醇-冰乙酸脱色液脱色，再通过薄层灰度扫描，确定蛋白质的表达量，获得分子量32KD的特异表达带，经蛋白质印迹分析，证明为Gal-9特异蛋白，蛋白质的表达量为40％；(5)经亲和层析柱纯化回收Gal-9蛋白，并在体内、外测定重组鸡Gal-9蛋白的抗菌与免疫作用，研究发现重组鸡Gal-9蛋白：1)能抑杀大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌，2)抗鸡传染性支气管炎病毒，3)经鸡口服后1周后，提高免疫鸡血清中抗鸡传染性支气管炎病毒抗体水平10-20％，提高鸡脾淋巴细胞转化率40-50％。