一种迟缓爱德华氏菌DNA疫苗及其构建和应用

摘要

本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说是一种迟缓爱德华氏菌DNA疫苗及其构建和应用。所述疫苗序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示。其制备方法：构建真核表达质粒pPC2和pCFC，在此基础上构建迟缓爱德华氏菌DNA疫苗质粒pFXV6。所得DNA疫苗悬液为对迟缓爱德华氏菌有免疫保护的作用。本发明所得DNA疫苗，一次免疫既可达到高保护效应。本发明的DNA疫苗对迟缓爱德华氏菌的免疫保护效率达74％。

主权项

一种迟缓爱德华氏菌DNA疫苗的构建方法，其特征在于：1)质粒pPC2的构建：将质粒pCI‑neo用XhoI/SmaI酶切，回收5.4kb片段，与寡聚核苷酸片段L86连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5，而后在含安卡青霉素(Ap)的LB固体培养基上培养，筛选转化子提取质粒，即为质粒pPC2；所述寡聚核苷酸片段L86为5’‑TCGAGATATCGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGACCC‑3’；2)质粒pCFC的构建：以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，用引物F8，F8为5’‑AGTACTGCCACCATGGCACAAGTAATCAACACCA‑3’和R6，R6为5’‑CCCGGGACGCAGCAGAGACAGGA‑3’，PCR扩增，PCR产物与PCR克隆载体pBS‑T连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α而后在含有100ug/ml Ap、40ug/mlXga1(5‑溴‑4‑氯‑3‑吲哚‑β‑D‑乳糖苷)和24ug/ml异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固体培养基上培养，筛选出白色转化子，得质粒pBSFC；所得质粒pBSFC用ScaI/SmaI酶切，回收1.2kb片段；将步骤1)的质粒pPC2用EcoRV酶切后回收5.4kb片段；将步骤1)的质粒pPC2酶切回收片段与质粒pBSFC酶切回收片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α后在含安卡青霉素的LB固体培养基上培养，筛选转化子提取质粒，即为pCFC；3)质粒pFXV6的构建：以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，用引物F5，F5为5’‑GGCTCGGCGGATCT‑3’和R8，R8为5’‑ATGGACGCGCAGATCAAA‑3’，PCR扩增，将PCR产物纯化；将步骤2)质粒pCFC用SmaI 酶切，回收6.6kb片段，将回收片段与纯化的PCR产物用T4DNA连接酶连接，连接混合液转化大肠杆菌DH5α后在含有100ug/ml Ap的LB固体培养基上培养，筛选转化子提取质粒，即为迟缓爱德华氏菌DNA疫苗。