一种包裹纳米金颗粒的叶酸功能化聚酰胺胺树状大分子载体的靶向基因转染方法

摘要

本发明涉及一种包裹纳米金颗粒的叶酸功能化聚酰胺胺树状大分子载体的靶向基因转染方法，包括：包裹纳米金颗粒的叶酸功能化聚酰胺胺树状大分子的制备；包裹纳米金颗粒的叶酸功能化聚酰胺胺树状大分子载体与质粒复合物的制备；复合物的靶向宫颈癌细胞转染及表达。本发明制备的载体用于基因转染具有转染条件温和，易于操作，转染效率高，特异性好等优点，在癌症治疗等方面具有很好的应用前景。

主权项

一种包裹纳米金颗粒的叶酸功能化聚酰胺胺树状大分子载体的靶向基因转染方法，包括：(1)称取叶酸(FA)，溶于二甲基亚砜(DMSO)中；称取1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶于DMSO中，将EDC溶液加到FA溶液中，搅拌反应4‑5h；得到活化的FA溶液；FA与DMSO的配比为4.22mg：3mL，EDC与DMSO的配比为18.33mg：2ml；称取第5代末端基团为氨基的聚酰胺胺树状大分子G5.NH₂，溶于DMSO中，配制成浓度为10.0mg/mL的G5.NH₂溶液；按照FA与G5.NH₂摩尔比为5：1，将活化的FA溶液加入G5.NH₂溶液中，室温下磁力搅拌，反应2‑4d；在上述溶液中加入HAuCl₄水溶液，混合搅拌20‑40min，然后加入NaBH₄溶液还原金酸盐，反应2‑4h；HAuCl₄与G5.NH₂摩尔比控制在25:1，HAuCl₄溶液与NaBH₄溶液的体积比为420：453；其中HAuCl₄水溶液浓度为30mg/mL；NaBH₄溶液的浓度为10mg/mL，溶剂中H₂O与CH₃OH的体积比为2:1；反应结束后，将反应产物在蒸馏水中透析2‑3天；然后进行冷冻干燥处理，得到包裹纳米金颗粒的叶酸功能化聚酰胺胺树状大分子Au DENPs‑FA反应产物；(2)按照N/P比2.5，取Au DENPs‑FA溶液用无菌水稀释，并用无菌水将相应质量的质粒稀释，然后混合均匀，37℃孵育30‑60min，得到Au DENPs‑FA/pDNA复合物；其中N/P比为树状大分子的伯氨基与pDNA骨架上磷酸基团摩尔比；(3)Hela细胞于37℃、5％CO₂培养24h，更换培养基，加入含Au DENPs‑FA终浓度分别为0nM、50nM、100nM、500nM、1000nM、2000nM和3000nM的细胞培养液，37℃、5％CO₂培养24h，加入MTT溶液，继续培养4h，去除培养基，加入DMSO，摇床振荡30min；测试吸光值，MTT与细胞数目的比例为100μg：10000个细胞，DMSO与细胞数目的比例为200μL：10000个细胞；(4)将Hela细胞于37℃、5％CO₂培养24h，更换无血清的DMEM培养基，加入AuDENPs‑FA/pDNA复合物溶液，摇匀，37℃培养4h后更换含10％FBS的DMEM培养基，继续培养24‑48h。