基于未变性染色皮粉底物的蛋白酶胶原蛋白水解活力测定方法及其应用

摘要

本发明提供了一种基于未变性染色皮粉底物的蛋白酶胶原蛋白水解活力测定方法，包括以下步骤：(1)制备染色皮粉：将由动物皮中间网状层制取的皮粉分散NaCl溶液中形成皮粉悬浮液，振荡使皮粉中的杂质充分进入液相，然后按照每质量份皮粉使用0.15～4.0质量份低温活性染料、0.05～1.2质量份固色剂的量，加入低温活性染料溶液，振荡使低温活性染料与皮粉中的胶原蛋白发生共价结合，再加入固色剂溶液，充分振荡后过滤，洗涤、脱水、干燥、粉碎即得；(2)测定染色皮粉标准曲线；(3)制备待测反应液和空白对照液；(4)测得吸光度值并计算酶活力。该方法可在酸性、中性和碱性条件下测定蛋白酶的胶原水解酶活力。

主权项

一种基于未变性染色皮粉底物的蛋白酶胶原蛋白水解活力测定方法，其特征在于包括以下步骤：(1)制备染色皮粉：将由动物皮中间网状层制取的皮粉分散在浓度为0.005～0.2g/mL的NaCl溶液中形成皮粉浓度为0.05～0.1g/mL的悬浮液，于10～45℃振荡使皮粉中的杂质充分进入液相，然后按照每质量份皮粉使用0.15～4.0质量份低温活性染料、0.05～1.2质量份固色剂的量，加入低温活性染料溶液，于10～45℃振荡使低温活性染料与皮粉中的胶原蛋白发生共价结合，再加入固色剂溶液，于10～45℃充分振荡后过滤，向所得固相皮粉中加入NH₄Cl溶液至液相呈中性，之后经过滤所得皮粉用水洗涤至洗出液呈无色，洗涤后的皮粉再经脱水、干燥、粉碎制得染色皮粉；(2)测定染色皮粉标准曲线：称取若干不同质量份的染色皮粉，分别向各染色皮粉中加入等量的缓冲液以及等量的蛋白酶溶液，于20～50℃振荡至各染色皮粉完全水解，得到染色皮粉水解产物的浓度呈梯度变化的若干份水解液，以检测波长测定各份水解液的吸光度值，以染色皮粉的浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线；(3)制备待测反应液和空白对照液向0.5～50mg染色皮中加入1～20mL缓冲液，加热至测定温度，加入将蛋白酶用水稀释N倍形成的蛋白酶溶液0.1～5mL，在振荡下于测定温度进行酶解反应T min，控制酶解反应的时间使染色皮粉不被完全消耗，酶解反应后立即离心，所得上清液即为待测反应液；向0.5～50mg染色皮粉中加入1～20mL缓冲液，加热至测定温度，于测定温度振荡T min，加入将蛋白酶用水稀释N倍形成的蛋白酶溶液0.1～5mL，立即离心，所得上清液即为空白对照液；(4)测得吸光度值并计算酶活力：取空白对照液和待测反应液在检测波长下测定吸光度值，分别记作A₀和A，根据式(1)计算计蛋白酶的胶原蛋白水解活力，$U=\frac{(A-A_0)\times V_1\times 1000}{T\times V_2\times K}\times N---\left(1\right)$式(1)中，U为蛋白酶的胶原蛋白水解活力，A₀和A分别为空白对照液和待测反应液的吸光度值，V₁为酶解反应后反应体系的总体积,mL，V₂为稀释N倍的蛋白酶溶液的加入量,mL，T为酶解反应的时间,min，K为标准曲线的斜率，N为蛋白酶的稀释倍数。