一种以壳寡糖为佐剂负载大肠杆菌菌毛黏附素的鸭疫里默氏菌菌影疫苗的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种以壳寡糖为佐剂负载大肠杆菌菌毛黏附素的鸭疫里默氏菌菌影疫苗的制备方法及应用。通过将从鸭源大肠杆菌克隆得到的编码fimA黏附素亚单位的pilA基因与噬菌体PhiX174的E基因，通过编码柔性连接臂(GLy₄Ser)₃的Linker连接，获得pilA、E的串联基因pilA-E，将该串联基因pilA-E与温控表达载体pBV220连接，构建温控表达载体pBV-pilA-E，将所述pBV-pilA-E电转化为鸭疫里默氏菌感受态细胞，并筛选阳性克隆体从而得到鸭疫里默氏菌工程菌，离心分离菌体，得到鸭疫里默氏菌菌影，将壳寡糖配的水溶液加入到菌检无活菌的鸭疫里默氏菌菌泥中，得到鸭疫里默氏菌菌影壳寡糖佐剂疫苗。本发明所提供的鸭疫里默氏菌菌影疫苗，可以通过饮水免疫，应用方便，适应规模化养殖。

主权项

一种以壳寡糖为佐剂负载大肠杆菌菌毛黏附素的鸭疫里默氏菌菌影疫苗的制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：（1）选择2型鸭疫里默氏菌临床分离株作为基础菌株，利用常规分子生物学技术，将从鸭源大肠杆菌克隆得到的编码fimA黏附素亚单位的pilA基因与噬菌体PhiX174的E基因，通过编码柔性连接臂(GLy₄Ser)₃的Linker连接，获得pilA、E的串联基因pilA‑E；（2）将该串联基因pilA‑E与温控表达载体pBV220连接，构建温控表达载体pBV‑pilA‑E，将所述pBV‑pilA‑E电转化为鸭疫里默氏菌感受态细胞，并筛选阳性克隆体得到鸭疫里默氏菌工程菌；（3）将所述鸭疫里默氏菌工程菌，在温度为20‑30℃条件下增菌培养至OD₆₀₀值为0.3‑1.0，然后迅速升温至40‑45℃诱导裂解基因；当OD₆₀₀值不再降低时，降温至30‑38℃，按5:1‑10:1的比例加入7‑12μg/mL的聚赖氨酸作用24‑30h，以充分灭活残存的活菌而不破坏其表面结构；（4）离心分离菌体，并冷冻干燥，然后进行菌体抽样，将抽样后的菌体稀释后涂平板进行检测，确证不存在活菌，即得到鸭疫里默氏菌菌影；（5）将壳寡糖的水溶液，加入到菌检无活菌的鸭疫里默氏菌菌泥中，充分搅拌形成均一混合物，使菌影含量达到5×10¹⁰ cfu/mL，分装，冷冻干燥，即得到鸭疫里默氏菌菌影壳寡糖佐剂疫苗。