一种生物磁分离筛选抗细菌活性抗菌肽的方法

摘要

本发明公开了一种生物磁分离筛选抗细菌活性抗菌肽的方法，属于生物活性肽的制备纯化领域；本发明以食源性蛋白为原料，利用蛋白酶对原料蛋白进行酶解，制备出含抗菌肽的组分，再利用磁性细菌细胞膜脂质体的生物磁分离结合高效液相指纹图谱和质谱技术，快速富集、鉴定及分离纯化食物源蛋白水解抗细菌活性抗菌肽；本发明采用磁性细菌细胞膜脂质体富集抗细菌活性抗菌肽，样品纯度高，与传统的蛋白酶释放、浸提、脱盐、凝胶过滤、离子交换柱层析及反相层析等繁琐抗菌肽筛选步骤相比，具有最大限度模拟抗菌肽与细菌细胞膜作用的生理条件、快速高效、温和准确、操作简单的优点。

主权项

一种生物磁分离筛选抗细菌活性抗菌肽的方法，其特征在于包括如下步骤：  （1）调节食源性蛋白原料粉与石油醚的料液比为1:5～1:10，用石油醚回流脱脂2～6h，过滤挥干石油醚得脱脂原料粉，在脱脂原料粉中添加蒸馏水，调节脱脂原料粉料液比1:10～1:15，pH 值至8.0～9.0，在4～10℃、500～800rpm条件下提取粗蛋白2～6h后，8000～10000g离心20～30min取上清液，调节上清液pH至4.0～5.0沉淀蛋白，蛋白沉淀用水洗2～3次，加水混合调 pH至中性后，将其置于‑80℃超低温冰箱中预冻2～6h，在‑55～‑45℃、压力0.03～0.2mBar下冻干24～72h即得粗蛋白冻干粉，4℃保存备用；  （2）在粗蛋白冻干粉中添加蒸馏水，控制料液比为1:10～1:25，然后在溶液中添加蛋白酶，在35～60℃、pH2.0～9.0下酶解1～6h后，100℃煮沸5～10min灭酶，8000～10000g离心20～30min取上清液，对上清液进行抗菌活性测定，取活性好的上清液过5K道尔顿的陶瓷膜，收集滤液，滤液用100道尔顿的透析袋20～25℃透析过夜即得蛋白酶解抗菌肽，‑20℃保存备用；  （3）将磷脂酰胆碱与磷脂酰甘油以质量比1～4:1的比例溶于无水乙醚中，冰浴间歇超声10～30 min使溶液均一，加入直径为50～100nm的磁性Fe₃O₄，4～10℃轻微振荡结合20～80min后旋转蒸发除去溶剂，通入氮气10～50min除净乙醚即为磁性细菌细胞膜脂质体；  （4）将步骤（2）中的蛋白酶解抗菌肽和步骤（3）磁性细菌细胞膜脂质体混合置于离心管中分散，在 20～37℃下震荡孵育20～60min，采用磁分离架将分散的磁性细菌细胞膜脂质体聚集，溶液即为蛋白酶解抗菌肽结合细菌细胞膜脂质体液；  （5）利用高效液相‑质谱技术检测蛋白酶解抗菌肽结合细菌细胞膜脂质体液的指纹图谱，收集并纯化未结合细菌细胞膜脂质体的蛋白酶解抗菌肽在相同保留时间峰形或峰面积变化的差异峰，测定抗细菌活力并进行序列鉴定，该差异峰抗菌肽即为抗细菌活性抗菌肽。