一种甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种新的保藏登记号为CGMCCNo.6793的甲基营养型芽孢杆菌，该菌株是从烟草根际土壤分离得到的，通过菌株的分离、纯化以及筛选步骤获得的。本发明进一步提供所述甲基营养型芽孢杆菌的发酵方法、由该方法制备所得的发酵产物，以及基于该发酵产物的生物菌剂及其制备方法，进一步地还提供所述生物菌剂防治多种植物病害的用途。该生物菌剂环境相容性好，有效活孢子数达50亿/克以上，具有很高的生物活性，特别是对由烟草青枯病具有较好的防效，其对烟草青枯病、白菜软腐病、水稻白叶枯病、水稻细菌性条斑病和棉花角斑病的防效高达80％以上。

主权项

一种甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂防治烟草青枯病的用途，其特征在于：所述甲基营养型芽孢杆菌，其属于芽孢杆菌属，其命名为Bacillus methylotrophicus；保藏登记号为CGMCCNo.6793，保藏机构为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间为2012年11月07日；所述菌株是从烟草根际土壤分离得到的；所述生物菌剂是通过如下步骤制得的：步骤一：菌种活化：将上述菌种接种到LB固体培养基上面，于30℃活化培养48h，所述LB固体培养基配方为酵母浸膏3‑5g，蛋白胨8‑10g，NaCl 5g，琼脂15～20g，水1000ml，pH 7.4～7.6，连续转接3代，确保菌株纯度后，再接种到种子液中使用；步骤二：种子液的制备：从LB固体培养基上挑取菌种接种到装有LB液体培养基的三角瓶中，于恒温振荡培养箱中振荡培养，即得到种子液，所述的LB液体培养基配方为：酵母浸膏3‑5g，蛋白胨8‑10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.4～7.6；培养条件：30℃，48h；步骤三：发酵培养：将种子液先后进行种子罐发酵培养和大规模工业发酵培养，得到发酵液；其中种子罐发酵培养和大规模工业发酵培养步骤分别如下：种子罐发酵培养：FJ液体培养基，装料系数0.7，培养条件：35‑37℃，42h，接种量：6％，通气量：2.5L/min，搅拌转速：200r/min；大规模工业发酵培养：FJ液体培养基，装料系数0.7，培养条件：35‑37℃，60‑70h，接种量：6％，通气量：2.0L/min，搅拌转速：220r/min；所述的FJ液体培养基配方为：黄豆饼粉1.5％，蔗糖1％，KH₂PO₄ 0.05％，MgSO₄0.02％，NaCl0.1％，其余为水，所列百分比为重量百分比；将上述发酵产物进一步制备生物菌剂：(1)：过滤并浓缩产物：将上述发酵产物用草酸调节pH至6.5‑7.0后，将发酵产物通过截留分子量40000‑100000k的无机陶瓷超滤膜过滤分离，操作温度为35‑37℃，膜通量为50‑60LMH，被截留在膜的进液侧的溶液为芽孢溶液，芽孢溶液浓缩倍数为6‑7倍，制得经浓缩的芽孢溶液，所述浓缩方法为使用50万Da的分子筛膜，蠕动泵流速为4档，通量为420ml/min，出液口压力为0.08MPa；(2)：喷雾干燥：向(1)的经浓缩的芽孢溶液中添加1.0％的填料，随后将芽孢溶液经喷雾制成粉末，喷雾干燥的进口温度为170‑190℃，出口温度为65‑85℃，进料速度60mL/min，喷头压力0.10MPa，即得到甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂；所述填料为白炭黑、微细滑石粉、轻质碳酸钙或2500目超细重钙；所述烟草青枯病是由烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)引起的。