抑制烟曲霉生物膜形成的方法

摘要

一种抑制烟曲霉生物膜形成的方法，属于生物技术领域。包括制备药物、收集菌株、制备载体、制备孢子悬液、药物敏感试验、抑制烟曲霉生物膜和电镜扫描，将配置好的不同浓度的异绿原酸A和受试菌株的孢子悬液加入到已经装有载体的24孔板内，静置于35~37℃的生化培养箱中培养，分别在24h和48h取出载体以电镜扫描观察生物膜形态。本发明提供的异绿原酸A和孢子悬液的药物组只看到菌丝，胞外基质很少甚至没有，异绿原酸A能够抑制烟曲霉生物膜形成。

主权项

一种抑制烟曲霉生物膜形成的方法，包括制备药物、收集菌株、制备载体、制备孢子悬液、药物敏感试验、抑制烟曲霉生物膜和电镜扫描，其特征在于，具体操作步骤如下：（1）制备药物 取400~500mg异绿原酸A用3~6ml 100%的二甲亚砜溶解，配制成浓度为90000~100000μg/ml的溶液，于‑20℃~‑25℃储存；（2）收集菌株 收集烟曲霉菌株，质控菌株为近平滑念珠菌；（3）制备载体 将1×1 cm²聚氯乙烯薄片用75%的乙醇浸泡15‑20min，后用无菌生理盐水浸洗，作为载体；（4）制备孢子悬液 将步骤（2）收集的菌株接种到PDA培养皿，置于35~37℃生化培养箱进行复苏，后转至另一个PDA培养皿并置于35~37℃生化培养箱活化3~5天后，用5~10ml含有0.025%吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，用20~30ml MOPS缓冲的RPMI‑1640重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，并用RPMI‑1640液体培养液调整浓度为1~3×10⁶·孢子·ml^‑1，再用RPMI‑1640液体培养基稀释50倍，得到2倍终浓度的孢子悬液；（5）药物敏感试验 微量液基稀释法，在无菌的96孔细胞培养板的第1至第10孔加入步骤（4）制备的孢子悬液，再将步骤（1）制备的异绿原酸A置于无菌的96孔细胞培养板的第1至第10孔，第1孔加入量为100μl，第2~10孔依次倍比稀释至二倍终浓度，第11孔为步骤（4）制备孢子悬液的生长对照孔，第12孔为MOPS缓冲的RPMI‑1640液体培养基，静置于35~37℃培养48h；获得异绿原酸A最低抑菌浓度MIC；（6）抑制烟曲霉生物膜 将步骤（4）制备的含有孢子悬液的载体水平放置于24孔板内，按照步骤（5）获得的MIC浓度，将亚抑菌浓度的异绿原酸A放入孔内，每个孔加入的量为1ml，静置于35~37℃的生化培养箱避光培养48~50h，间隔24h用相同药物换液；（7）电镜扫描 将步骤（6）制备的烟曲霉生物膜在培养时间为24h和48h用扫描电镜进行形态观察。