一种百合隐症病毒和百合斑驳病毒复合胶体金免疫层析检测试剂卡及制备方法

摘要

一种百合隐症病毒和百合斑驳病毒复合胶体金免疫层析检测试剂卡及制备方法，该试剂卡包括试剂卡槽、衬板、样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸，其中胶体金结合垫上含有复合金标探针，衬板固定于试剂卡槽中，样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次排列连接于衬板上表面，硝酸纤维素膜上设有2条检测线和1条对照线，2条检测线上分别包被的是兔抗LSV和LMoV多克隆抗体，对照线上包被的是羊抗兔IgG纯化抗体；该LSV和LMoV复合胶体金免疫层析检测试剂卡的制备方法主要是将兔抗LSV和LMoV多克隆抗体分别包被于免疫层析膜上，同时用其制成复合胶体金结合垫；该试剂卡可同时检测LSV和LMoV，且准确率高、特异性强，无需特殊的设备和仪器。

主权项

一种百合隐症病毒和百合斑驳病毒复合胶体金免疫层析检测试剂卡的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：①兔抗LSV和LMoV多克隆抗体的制备：分别从感染了LSV和LMoV的百合叶片中提取总RNA进行逆转录聚合酶链式反应（RT－PCR），扩增LSV和LMoV的CP基因片段；通过酶切克隆至pET－28a 载体；重组质粒转化入大肠杆菌BL21，37℃培养，IPTG诱导表达，镍柱亲和层析纯化分别获得大小为32.0、30.0 kDa的LSV CP和LMoV CP基因工程融合蛋白；分别用1mg/mL的LSV CP和LMoV CP基因工程融合蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔，获得抗血清；所得抗血清依次通过20%、50%、33%三个饱和度的硫酸铵沉淀粗提后，透析至pH7.8的磷酸缓冲液，然后使用DE52阴离子交换柱进行纯化分别获得兔抗LSV和LMoV多克隆抗体IgG；②胶体金标记兔抗LSV和LMoV多克隆抗体的方法：分别取半径为30nm的胶体金10mL、兔抗LSV和LMoV多克隆抗体各180μg，在pH 7.5的条件下通过磁力搅拌震荡使其结合，加牛血清白蛋白（BSA）作为稳定剂，且使得终浓度为1%，采用高速离心法除去未结合的多克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及其凝聚物，在离心管底部的深红色沉淀即为复合胶体金－抗体结合物；③复合胶体金结合垫的制备：用1/10标记前胶体金溶液体积的重悬液悬浮复合胶体金－抗体结合物，离心，上清液用喷涂设备涂于玻璃纤维素膜上，37℃烘干，制成复合胶体金结合垫；④免疫层析膜的包被：在硝酸纤维素膜上分别包被兔抗LSV和LMoV多克隆抗体检测线（4）、（5）和羊抗兔IgG纯化抗体对照线（6），每条线宽2mm，兔抗LSV多克隆抗体包被量为 2.0～2.5μg蛋白，兔抗LMoV多克隆抗体包被量为1.5～2.0μg蛋白，羊抗兔IgG纯化抗体包被量为 2.5～3.0μg蛋白；⑤复合试剂卡的组装：将聚氯乙烯衬板作为支撑载体固定于试剂卡槽下壳体中，然后样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次排列连接于聚氯乙烯衬板上表面，再将试剂卡槽上壳体与下壳体通过卡扣连接，就得到LSV和LMoV复合胶体金免疫层析检测试剂卡；其中上壳体设有第一孔洞和第二孔洞，样品垫置于第一孔洞下方，硝酸纤维素膜置于第二孔洞下方；所述LSV和LMoV分别为百合隐症病毒和百合斑驳病毒。