共表达SAL-2和hLYZ双抑菌基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用

摘要

本发明公开了一种共表达SAL-2基因和hLYZ双抑菌基因重组腺病毒载体的构建方法及重组腺病毒和应用，采用从金黄色葡萄球菌噬菌体基因组和人乳体细胞总RNA中分别扩增出的SAL-2基因和hLYZ基因，将获得的目的基因克隆到pShuttle-IRES-hrGFP-2穿梭载体中，线性化重组穿梭载体后与骨架载体pAdeasy-1共转染大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使其在BJ5183内进行同源重组，构建了包含上述目的基因的重组腺病毒质粒Ad-SAL-LYZ；将重组腺病毒质粒由PacⅠ酶切后，经脂质体介导转染HEK293细胞，包装获得高滴度的重组腺病毒；评价SAL-2基因和hLYZ基因在腺病毒介导下对奶牛乳房炎主要致病菌的联合抑制作用。

主权项

一种共表达SAL‑2和hLYZ双抑菌基因重组腺病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)从金黄色葡萄球菌噬菌体基因组DNA和人乳体细胞总RNA中分别扩增出SAL‑2基因序列GI:NC_009875和hLYZ基因序列GI:NM_000239；所述的SAL‑2基因和hLYZ基因的扩增包括：以SAL‑F SEQ ID NO：1和SAL‑R SEQ ID NO：2为引物，以金黄色葡萄球菌噬菌体基因组DNA为模版，扩增SAL‑2基因序列；以LYZ‑F SEQ ID NO：3和LYZ‑R SEQ ID NO：4为引物，以人乳体细胞总RNA为模版，扩增hLYZ基因序列；以rSAL‑F SEQ ID NO：5和rSAL‑R SEQ ID NO：6为引物，以金黄色葡萄球菌噬菌体基因组DNA为模版，扩增两端为不同限制性酶切位点的SAL‑2基因序列；2)将获得的目的基因分别克隆到pShuttle‑IRES‑hrGFP‑2穿梭载体中，线性化重组穿梭载体后与骨架载体pAdeasy‑1共转染大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使其在BJ5183内进行同源重组，构建了包含目的基因的重组腺病毒质粒pAd‑SAL‑LYZ；3)将重组腺病毒质粒由PacⅠ酶切后，经脂质体介导转染HEK293细胞，包装获得重组腺病毒Ad‑SAL‑LYZ。