一种检测玉米细菌性枯萎病菌的双抗体夹心酶联免疫法

摘要

一种检测玉米细菌性枯萎病菌的双抗体夹心酶联免疫法，属于免疫分析领域。本发明用玉米细菌性枯萎病菌NCPPB 449（来自湖南省进出口检验检疫局）免疫BALB/c小鼠，经免疫、融合、筛选得5株玉米细菌性枯萎病菌单抗。5株抗体分别标记HRP并以该菌体进行两两配对。以11C2（单克隆细胞株H号）为包被抗体，10B1（单克隆细胞株I号）为酶标抗体，以NCPPB 449菌体为标准品建立夹心ELISA法。LOD为1.5×10⁴ cfu/mL，线性范围4.57×10⁵~1.11×10⁸cfu/mL。本发明用理化性质高度均一、特异性好、可大量制备的单克隆抗体，建立的夹心法灵敏度高，成本低，与丁香假单胞杆菌斑点致病变种等无交叉反应，为玉米种子中玉米细菌性枯萎病菌的检测提供了快速高效的分析手段。

主权项

一种基于单克隆抗体的检测玉米种子中玉米细菌性枯萎病菌的双抗体夹心酶联免疫法，其特征在于（1）玉米细菌性枯萎病菌单克隆抗体的制备    单克隆抗体是采用玉米细菌性枯萎病菌NCPPB 449菌体经过特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，经杂交瘤技术融合、筛选得到的；（2）单克隆抗体的配对筛选将纯化后的5株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对；配对参数如下：包被抗体2μg/mL；包被液为0.01M、pH9.6的碳酸盐缓冲液；标品浓度1×10⁸cfu/mL；标品稀释液0.01M、pH7.2 的PBS；酶标抗体稀释500倍使用；在此条件下，实验成功得到了5对P/N值>5的配对；（3）夹心法的建立选择检测限稳定、灵敏的配对，即以单克隆细胞株H号即CGMCC No.9308为包被抗体，单克隆细胞株I号即CGMCC No.9309作为酶标抗体建立夹心法；具体参数如下：包被抗体浓度：2 μg/mL包被液：0.01M、pH 9.6碳酸盐缓冲液标品稀释液：0.01M、pH7.2 PBS+0.2%Tween酶标抗体浓度：2.5μg/mL反应时间：包被抗体：封闭37℃，2h；标准品：37℃，1h；酶标抗体：37℃，1h；显色10min；优化后玉米细菌性枯萎病菌夹心法的LOD：1.5×10⁴ cfu/mL。