一种从鸡软骨中提取纯净Ⅱ型胶原的方法

摘要

本发明公开了一种从鸡软骨中提取纯净Ⅱ型胶原的方法，其特点是将新鲜鸡软骨选作原材料，先去除其他非软骨成分、进行脱脂预处理，然后用4mol/L NaCl-0.05mol/L Tris-HCl溶液除去可溶性杂蛋白，用4mol/L盐酸胍-0.05mol/L Tris-HCl(PH 7.5)溶液除掉不溶性杂蛋白，用含1-2％胃蛋白酶的醋酸溶液酶解固体物质后，离心取上清液，采用NaCl最终浓度为3-4.2mol/L、1.2-1.8mol/L、0.8-1.0mol/L逐次盐析去除其它类型的胶原，再反复用NaCl最终浓度为0.8-1.0mol/L盐析操作2-5次，最后透析得到纯净的Ⅱ型胶原。该方法制备出的Ⅱ型胶原类型单一、生物活性高、理化性能稳定，同时本方法操作简单，有利规模化生产。

主权项

一种从鸡软骨中提取纯净Ⅱ型胶原的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：所述原料按重量份计：1)软骨的预处理将新鲜的鸡软骨表面剔除其他非软骨成分，取100‑200份，用生理盐水洗涤，加入脱脂剂液浸泡，每隔10‑15h更换一次，24‑60h后倒掉，用冷水清洗3‑5次，再将软骨浸泡于冷水中过夜，取出捣碎，得到软骨浆液；2)杂蛋白的去除：去除可溶性蛋白：配制4mol/L NaCl‑0.05mol/L Tris‑HCl混合溶液H1，pH为7.5，在步骤1)中得到的软骨浆液里加入上述配制的混合溶液H1，料液比为1:5‑25，搅拌12‑36h，离心处理，留下沉淀，冷水反复清洗3‑5次，得到沉淀物；去除不溶性蛋白：配制4mol/L盐酸胍‑0.05mol/L Tris–HCl混合溶液H2，pH为7.5，在上述沉淀物中加入配好的混合溶液H2，料液比为1:10‑40，混匀搅拌，12‑36h后离心取出固体物质，冷水反复清洗3‑5次，得到固体物质；3)胃蛋白酶酶解：配制稀醋酸溶液，在步骤2)中得到的固体物质里加入稀醋酸溶液，料液比为1:5‑20，混合均匀后，加入质量分数为1‑2wt％胃蛋白酶，搅拌24‑72h，离心取上清液，沉淀反复酶解，直至无沉淀，得到上清液；4)Ⅱ型胶原的提取、纯化：去除Ⅸ型胶原：将步骤3)中得到的上清液用2mol/L醋酸调节pH至2.5‑3.5，加入固体NaCl至最终浓度为3‑4.2mol/L，搅拌1‑2h，静置过夜，离心处理，得到沉淀S1；去除Ⅹ型胶原：沉淀S1溶于稀醋酸，调节pH至2.5‑3.5，加入固体NaCl至最终浓度为1.2‑2.0mol/L，搅拌1‑2h，静置过夜，离心处理，得到沉淀S2；去除Ⅺ型胶原：沉淀S2溶于稀醋酸，调节pH至2.5‑3.5，加入固体NaCl至最终浓度为0.8‑1.0mol/L，搅拌1‑2h，静置过夜，离心处理，得到沉淀S3；沉淀S3溶于稀醋酸，调节pH至2.5‑3.5，加入固体NaCl至最终浓度为0.8‑1.0mol/L，重复此操作2‑5次，即得Ⅱ型胶原提取液；将得到的Ⅱ型胶原提取液灌入透析袋，用1‑5mmol/L醋酸充分透析，得纯净的Ⅱ型胶原；5)以上步骤中除特殊说明外，均在温度15℃以下进行。