DNA氧化损伤与骨细胞凋亡在缺血坏死中作用的实验方法

摘要

本发明公开了一种造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡在缺血坏死中作用的实验方法，该方法包括以下步骤：实验分组及动物模型的建立，标本制作，光镜下组织形态学观察，透射电子显微镜观察，TUNEL法检测骨细胞凋亡情况，单克隆抗体N45.1免疫组织化学法检测骨髓造血细胞DNA氧化损伤，统计学处理。本方法分别于最后一次给药后第二周、第四周处死实验动物，每次每组5只；取双侧股骨头常规固定脱钙待测，HE染色计数空缺骨陷窝、电镜观察骨细胞形态变化、TUNEL法检测骨细胞凋亡、免疫组织化学法检测骨髓造血细胞DNA氧化损伤，探明SANFH与骨髓造血细胞DNA氧化损伤及骨细胞凋亡之间的关系，为进一步探讨激素性股骨头缺血坏死的发病机理提供新的思路。

主权项

一种造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡在缺血坏死中作用的实验方法，其特征在于，该实验方法包括以下步骤；步骤一、实验分组及动物模型的建立；步骤二、标本制作；步骤三、光镜下组织形态学观察；步骤四、透射电子显微镜观察；步骤五、TUNEL法检测骨细胞凋亡情况；步骤六、单克隆抗体N45.1免疫组织化学法检测骨髓造血细胞DNA氧化损伤；步骤七、统计学处理；实验分组及动物模型的建立的具体方法如下：采用随机数字表法，将实验动物随机分成A、B、C、D四组；A组：10只，为模型组，静脉内注射大肠杆菌内毒素，共两次，每次100μg/kg，间隔24h，在第2次注射完大肠杆菌内毒素后随即肌肉注射甲基强的松龙，共3次，每次20mg/kg，间隔24h；B组：10只，为对照组，静脉注射大肠杆菌内毒素，共两次，每次100μg/kg，间隔24h，在第2次注射完大肠杆菌内毒素后随即肌肉注射生理盐水，共3次，每次20mg/kg，间隔24h；C组：10只，为对照组，静脉注射生理盐水，共两次，每次100μg/kg，间隔24h，在第2次注射完生理盐水后随即肌肉注射甲基强的松龙，共3次，每次20mg/kg，间隔24h；D组：10只，为对照组，静脉注射生理盐水，共两次，每次100μg/kg，间隔24h，在第2次注射完生理盐水后随即肌肉注射生理盐水，共3次，每次20mg/kg，间隔24h；将动物在最后一次注射后分别于第二、第四周空气栓塞法处死动物，每次每组5只，在相对无菌的条件下取双侧股骨头；实验动物为成年健康日本大耳白兔40只，雌雄不限，体重2.5±0.5kg，标准饮食，单笼喂养；标本制作的方法如下：两次所取股骨头，一侧用5％戊二醛溶液固定，另一侧用10％甲醛溶液固定，固定时间为一周，15％乙二胺四乙酸即EDTA脱钙45天，常规石蜡包埋；光镜下组织形态学观察的方法为：(1)取石蜡包埋组织块，制成厚4um切片，HE染色：A、二甲苯I 5min；B、二甲苯II5min；C、95％乙醇I 3min；D、95％乙醇II 3min；E、80％乙醇1min；F、蒸馏水1min；G、苏木精液染色10min；H、流水稍洗去苏木精液3s；I、1％盐酸乙醇3s；J、稍水洗30s；K、促蓝液返蓝30s；L、流水冲洗15min；M、蒸馏水过洗2s；N、0.5％曙红液染色3min；O、蒸馏水稍洗2s；P、80％乙醇稍洗2s；Q、95％乙醇I 5min；R、95％乙醇II5min；S、无水乙醇5min；T、无水乙醇5min；U、二甲苯I5min；V、二甲苯II5min；W、二甲苯III5min；X、中性树胶封固；(2)将(1)切片分别置于OLYMPUS显微镜100倍及400倍光镜下观察组织病理学改变；骨细胞坏死病理变化用空缺骨陷窝百分数表示，即在100倍放大倍率下，任选5个高倍镜视野，每个视野计数50个骨陷窝，分别数出空缺骨陷窝数，求出空缺骨陷窝所占的百分数；激素性股骨头坏死判定标准：股骨头软骨下区空缺骨陷窝率作为激素性股骨头坏死的组织学判定指标，正常成年家兔股骨头软骨下区空缺骨陷窝率为8％‑12％，同等制片条件下股骨头软骨下空缺骨陷窝率超过正常值即提示骨坏死；透射电子显微镜观察的方法如下：取5％戊二醛固定的股骨头组织，于股骨头软骨下0.2‑0.3cm切取1mm×1mm×1mm大小骨块，5％硝酸脱钙2‑3h，1％四氧化锇后固定1h，梯度酒精脱水，环氧树脂包埋，包埋剂与无水乙醇分别以1∶1、2∶1、3∶1浓度混合逐层置换无水乙醇，包埋，37℃恒温箱24h浸透，60℃烤箱聚合48h，超薄切片机制备50nm超薄切片，染色即醋酸双氧铀、柠檬酸铅双染色；将超薄切片置于电子显微镜下观察；TUNEL法检测骨细胞凋亡情况的方法为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法；试剂组成：A、磷酸缓冲液PBS pH7.4；B、蛋白酶K 200μg/ml，pH7.4；C、含2％H₂O₂的PBS缓冲液pH7.4；D、TdT酶缓冲液；E、TdT酶反应液；F、洗涤与终止反应缓冲液；G、0.05％二氨基联苯溶液；H、0.5％甲基绿pH4.0；I、100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％乙醇，二甲苯，10％中性甲醛溶液，乙酸；J、过氧化物酶标记的抗地高辛抗体；缺口末端标记法实验步骤：A、标本预处理：将制备好的石蜡组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次5min，用无水乙醇洗两次，每次3min，用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min，用PBS洗5min加入蛋白酶K溶液20ug/ml，于室温水解15min，去除组织蛋白；用蒸馏水洗4次，每次2min；B、色缸中加入含2％过氧化氢的PBS，于室温反应5min，用PBS洗两次，每次5min；C、用滤纸吸去载玻片上组织周围的液体，在切片上加2滴TdT酶缓冲液，置室温1～5min；D、用滤纸小心吸去切片周围的液体，在切片上滴加54μl TdT酶反应液，置湿盒中于37℃反应1小时；E、将切片置于染色缸中，加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液，于37℃保温30min，每10min将载玻片提起和放下一次，使液体搅动；F、组织切片用PBS洗3次，每次5min后，直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30min；G、用PBS洗4次，每次5min；H、在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05％DAB溶液，室温显色6min；I、用蒸馏水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min；J、于室温用甲基绿进行复染10min，用蒸馏水洗3次，前两次将载玻片提起放下10次，最后1次静置30s；依同样方法再用100％正丁醇洗三次；K、用二甲苯脱水3次，每次2min，封片、干燥后，OLYMPUS显微镜下观察并记录实验结果；每张切片随机选5个高倍镜视野，每个区域计数50个骨细胞，计算凋亡细胞指数即凋亡细胞数/视野中细胞总数；单克隆抗体N45.1免疫组织化学法检测骨髓造血细胞DNA氧化损伤的方法如下：A、切片置于0.3％H₂O₂中37℃下孵育30min；B、0.1％胰蛋白酶消化15min；C、加入单克隆抗体N45.1一滴，37℃下孵育2h；D、DAB显色5min；E、HE复染；统计学处理的方法如下：数据均以表示，用Spss13.0软件进行统计分析，空缺骨陷窝率、骨髓造血细胞DNA氧化损伤率、骨细胞凋亡指数的统计检验采用方差分析，多个样本均数的两两比较采用LSD检验。