一种目的蛋白制备方法及其用途

摘要

本发明涉及一种目的蛋白制备方法及其用途。其制备方法为，目的蛋白核苷酸序列片段的获得；目的蛋白重组表达载体的构建；目的蛋白的诱导表达；纯化；切割；目的蛋白核苷酸序列片段的前面插入单体切割的识别位点；优选可在目的蛋白的核苷酸序列片段上游引入kex2酶切位点，在下游引入盐酸羟胺切割位点；目的蛋白的核苷酸序列片段通过SOE技术获得，并通过引物引入单体切割的识别位点；目的蛋白可以是人神经生长因子，胸腺肽、虎纹克胰肽、虎纹镇痛肽等。制备得到的目的蛋白表达量高、易于纯化、基因表达产物即为目的蛋白单体，不带额外氨基酸残基，既保证了目的蛋白产物良好的生物学活性，也省去了多拷贝的切割成本，纯化简单，易于大量生产。

主权项

一种目的蛋白的制备方法，其特征是：包括如下步骤，目的蛋白核苷酸序列片段的获得；所述目的蛋白是虎纹镇痛肽；步骤为：合成SEQ ID NO:1‑4序列，其中SEQ ID NO:1引入酵母kex2酶切位点；SEQ ID NO:4引入盐酸羟胺切割位点；通过SOE法获得虎纹镇痛肽成熟肽的编码基因；PCR反应体系为：10×PCR缓冲液5μL，dNTP4μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，10μmol/L的SEQ ID NO:1、4各5μL，10μmol/L的SEQ ID NO:2、3各0.2μL，加双蒸水至50μL；PCR反应程序：先94℃预变性5min，70℃变性30s；30℃退火30s，37℃延伸30s，70℃保持60s；其后94℃预变性5min，然后进行35个循环的60℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后再72℃保持5min，冷却4℃，即得到目的蛋白核苷酸序列片段；目的蛋白重组表达载体的构建；将所得片段用EcoR I和Sal I双酶切克隆入同样双酶切的载体PUC57上得到含一个拷贝虎纹镇痛肽串联基因的重组载体；同样方法完成2个及其2个以上拷贝虎纹镇痛肽串联基因的重组载体；将含有不同拷贝虎纹镇痛肽串联基因的重组载体经EcoR I/Not I双酶切后回收虎纹镇痛肽基因，再经T₄连接酶连接到经EcoR I/Not I双酶切后回收的pPIC9K载体中，构建不同拷贝虎纹镇痛肽串联编码基因毕赤酵母表达载体；目的蛋白的诱导表达；将其电转化至毕赤酵母GS115进行诱导表达；目的蛋白的纯化；所述纯化采用弱阳离子交换柱离子交换层析；纯化产物的切割。