霍山石斛组织培养一步成苗的方法及使用的营养液的配方

摘要

一种霍山石斛组织培养一步成苗的方法，包括下述步骤：固体培养基的制备，其中固体营养基的配方包括：大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、激素以及添加物；液体营养液的制备：液体营养液的配方按照固体培养基的配方，不添加激素、琼脂、矮壮素和香蕉苹果提取液；霍山石斛果荚的选择和消毒；霍山石斛种子悬浮液的制备；无菌播种；种苗培养；出苗。采用上述方法进行霍山石斛的培育的优点在于：缩短了霍山石斛的培养周期，6个月可以出苗，即在种子成熟的10月份播种，第二年的4月份就可以出苗，刚好赶在栽苗期；降低了50％的霍山石斛组培育苗的生产成本，减少了种植投入；增加栽培的成活率和发芽率。

主权项

一种霍山石斛组织培养一步成苗的方法，其特征在于：包括下述步骤：步骤一：固体培养基的制备，其中固体营养基的配方包括：以下组成及配比的大量元素：硝酸钾 KNO₃：300～500mg/L；硫酸铵 (NH4)2SO4：400～600mg/L；磷酸二氢钾 KH2PO4：300～500mg/L；硫酸镁 MgSO4.7H2O：200～300mg/L；硝酸钙 Ca(NO4)2：400～500mg/L；以下组成及配比的微量元素：碘化钾 KI：0.65～0.95mg/L；硼酸 H3BO3：5.3～8.9mg/L；硫酸锰 MnSO4.4H2O：19～25mg/L；硫酸锌 ZnSO4.7H2O：6.5～9.8mg/L；钼酸钠 Na2MoO4.2H2O：0.10～0.45mg/L；硫酸铜 CuSO4.5H2O：0.010～0.035mg/L；氯化钴 CoCl2.62：0.010～0.035mg/L；以下组成及配比的铁盐：乙二胺四乙酸二钠 Na2.EDTA：25.5～40.5mg/L；硫酸亚铁 FeSO24.7H2O：22.5～30.5mg/L；以下组成及配比的有机成分：肌醇 CH(OH)6：90～110mg/L；甘氨酸 C2H5NO2：1～3mg/L；盐酸硫胺素 VB1：0.05～0.15mg/L；盐酸吡哆醇 VB6：0.4～0.6mg/L；烟酸 VB5或VPP：0.4～0.6mg/L；以下组成及配比的激素：萘乙酸 NAA：0.6～0.9mg/L；6‑苄氨基嘌呤 6‑BA：0.4～0.6mg/L；以下组成及配比的添加物：蔗糖：25～35g/L；琼脂：3.5～5.5mg/L；花宝1号：1.5～2.5mg/L；香蕉苹果混合提取液(2～4:1～2)：120～200g/L；所述固体培养基的生产流程包括：水加热沸腾后，加入上述配方的琼脂，形成琼脂初混液，将上述组成及配比的添加物加水加热粉碎并浸出形成添加物浸出液，该添加物浸出液与上述琼脂初混液混合形成琼胶液，在该琼胶液内按上述组分和配方加入大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、激素，然后搅拌均匀，形成培养基初液，调节培养基初液ph值至5.6‑6.0，温度维持在50度到70度之间进行分装，分装后100℃～150℃灭菌10min～30min备用；步骤二：液体营养液的制备：液体营养液的配方按照固体培养基的配方，不添加激素、琼脂、花宝1号和香蕉苹果提取液，所述液体营养液的生产流程包括：水加热沸腾后，按照液体营养液的配方加入各组分，混合定容后，调节培养基初液ph值至5.6‑6.0，温度维持在50度到70度之间进行分装，分装后100℃～150℃灭菌10min～30min备用；步骤三：霍山石斛果荚的选择和消毒：选择当年成熟饱满的霍山石斛硕果，表面无病斑、虫蛀和开裂，将采收的霍山石斛硕果进行清理，去除硕果表面枯萎的残花，并用清水反复冲洗，然后放入75％的酒精中至淹没为止，浸泡20min～50min，然后放在无菌的接种盘中在无菌操作台上晾干，备用；步骤四：霍山石斛种子悬浮液的制备：无菌室超净工作台面上，用手术刀在硕果的一端切开一个小口子，用镊子夹住果柄，将切口对准瓶口，用另一只镊子轻轻敲打夹住果柄的镊子，将种子均匀的散落营养液中，并在无菌的环境下用磁力搅拌器将悬浮液搅拌均匀，并用悬浮计数法在显微镜下用计数板检测种子在悬浮液的密度，要求达到80～120粒/ml的密度；步骤五：无菌播种：在无菌操台上，用灭菌后的移液枪从种子悬浮液中抽取1ml，放入固体培养基中，盖好瓶盖缓慢晃动，直至瓶内的悬浮液均匀的平铺在培养基表面为止，放入培养框中，送至培养室培养；步骤六：种苗培养，刚开始10天是种子萌发阶段，采用暗培养，无光照，温度控制在24℃～27℃，10天‑70天，为发芽阶段，这一时间段内，保证光照时间7～9小时，光照强度1500lux‑2000lux，温度控制在25℃～28℃，70天～120天，为发生根阶段，这一时间段内，保证光照时间9～12小时，光照强度1800lux‑2100lux，温度控制在24℃～27℃，120天～180天，为壮苗阶段，这一时间段内，保证光照时间9～12小时，光照强度2500lux‑3000lux，温度控制在24℃～27℃。在培过程中，若发现固体培养基被种苗吸收完不能够满足种苗继续生长需要时，用无菌移液枪在无菌操作台上将灭菌后的液体营养液加至培养瓶中，供应种苗继续生长；步骤七：出苗。