一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法

摘要

本发明公开了一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法，属基础研究领域；本发明超声微泡制备使用的材料为：DSPC、DSPE-PEG2000-malei mide、DSPE-PEG2000-Biotin、iRGD肽、抗CCR2抗体、硬脂酸、支链聚醚酰亚胺-600、N，N’-羰基二咪唑、抗生物素蛋白；本发明将靶向Integrinαvβ3的iRGD穿膜肽与抗CCR2抗体结合至微泡表面，构建双靶向阳离子超声造影剂，具有携载质粒DNA和靶向肿瘤细胞双重功能，联合超声介导的生物学效应和iRGD的穿膜作用，促进基因进入肿瘤细胞内，提高基因转染效率，有望发展应用于可视化超声控释基因治疗肿瘤。

主权项

一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：(1)DSPE‑PEG2000‑iRGD的制各①称量：按照摩尔比1.5∶1称量药品iRGD和DSPE‑PEG2000‑maleimide；②溶解：将药品iRGD和DSPE‑PEG2000‑maleimide移入西林瓶中，加双蒸水4ml溶解，吹匀；③反应：将装有药品的西林瓶置于冰块中，磁力搅拌24h；④透析：取一大烧杯，装满蒸馏水，将反应后的溶液转移至透析袋内(Mw：3500)置于大烧杯内，将大烧杯维持在冰块环境中，磁力搅拌透析48h，每隔4h换一次双蒸水以及冰块；⑤冷冻干燥：透析完毕后，将透析好的溶液转移至西林瓶中，置于‑80℃中冻存约4h至固体，取出置冷冻干燥机中干燥48h；⑥存放：干燥完毕后，封口，贴标签，于‑20℃中保存；(2)Stearic‑PEI600的制备①取0.35gN，N’‑羰基二咪唑(CDI)和0.6g硬脂酸(Stearic)分别溶解于10ml无水氯仿中，0.7g支链PEI600溶解于20ml无水氯仿中，分别得N，N’‑羰基二咪唑溶液、硬脂酸溶液、支链PEI600溶液备用；②将①中所得的N，N’‑羰基二咪唑溶液进行磁力搅拌，在不断磁力搅拌下，将①中所得的硬脂酸溶液逐滴加入N，N’‑羰基二咪唑溶液中，得混合物溶液一，将混合物溶液在氩气保护下反应2小时后，再将其逐滴加入支链PEI600溶液中，得混合物溶液二备用；③将②中所得的混合物溶液二在氩气保护下于室温环境中进一步搅拌24小时，所得产物在冷乙醚中沉淀纯化，然后放入大型离心机中清洗除去未反应的溶剂10min，收集上清液得到纯化的Stearic‑PEI600；然后将清洗收集后的Stearic‑PEI600溶液放入真空干燥机中干燥数小时，完毕后置于‑20℃储物箱中保存，制备微泡时将其融于无水氯仿中使用；(3)双靶向阳离子超声微泡的制备①将DSPC、Stearic‑PEI600、DSPE‑PEG2000‑iRGD、DSPE‑PEG2000‑Biotin溶解于三氯甲烷中，按摩尔比8.5∶0.5∶0.5∶0.5取上述配制的溶液于干净试管中，将试管置于旋转仪，使用干燥的N₂气流除去溶剂使其在试管壁上形成一层均匀的薄膜，真空烘箱中干燥3小时以上，备用；②在试管中加入一定体积的Tris缓冲溶液，得到一定浓度的磷脂溶液，加热磷脂溶液到其相转变温度(55‑60℃)以上，并用水浴超声制成透明的磷脂溶液，将所得磷脂溶液分装入洁净西林瓶中(1ml/瓶)，用全氟丙烷(C3F8)置换瓶中的空气，机械震荡器震荡30s后形成生物素化的阳离子MBiRGD微泡；③将所得生物素化的阳离子MBiRGD微泡用PBS借助离心漂浮法清洗三次，然后加入60μg抗CCR2抗体孵育20分钟，离心清洗除去过量的未结合的抗体，制得携iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡。