一种汞离子快速检测金标试纸条或卡

摘要

本发明公开了一种用于快速检测汞离子的金标试纸条／卡，包括底层支撑板(1)、样品垫(2)、金标抗体结合垫(3)、纤维素膜(4)、吸水垫(5)。本发明可以实现对环境、土壤、水、食品、药物、化妆品中铅离子污染残留的快速检测。

主权项

一种用于快速检测汞离子的金标试纸条，包括底层支撑板(1)、样品垫(2)、金标抗体结合垫(3)、纤维素膜(4)、吸水垫(5)，其特征在于：所述试纸条是以底层支撑板为底部支撑，将样品垫、金标抗体结合垫、纤维素膜、吸水垫和包被膜依次粘贴于底层支撑板上，所述底层支撑板和外卡均由硬质塑料制成，所述样品垫与金标抗体结合垫以玻璃纤维棉为基质，所述金标抗体结合垫包被有胶体金标记的能识别汞离子的单克隆抗体；所述纤维素膜中部依次平行排列有隐形检测线(T线)和质控线(C线)，检测线包被有汞离子与载体蛋白通过螯合剂形成的偶联物，质控线包被有兔抗鼠IgG(RaMIgG)或羊抗鼠IgG(GaMIgG)；所述的螯合剂选自异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、还原谷胱甘肽(GSH)中的一种；所述载体蛋白选自鸡卵清白蛋白(OVA)，所述的偶联物为Hg²⁺‑ITCBE‑OVA；所述的金标试纸条通过包括如下步骤在内的方法制备得到：(1)称取20mg OVA溶于1mL pH9.0的10mM/LHEPES缓冲液中形成20mg/mL的载体蛋白溶液；(2)称取10mg ITCBE溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)中形成金属螯合剂溶液；(3)将0.5mL金属螯合剂溶液逐滴加到OVA载体蛋白溶液中，混匀后，加入100μl的1.5M三正丁胺，摇床室温反应24h，制成OVA‑ITCBE溶液；(4)取11.25mg硝酸汞(Hg(NO₃)₂)溶于100μL蒸馏水中，形成均匀的Hg²⁺溶液；(5)将Hg²⁺溶液加入到OVA‑ITCBE溶液中，调节pH值至7.4，在室温下，摇床孵育4h，然后移入透析袋中PBS透析10d，即形成Hg²⁺‑ITCBE‑OVA，收集分装，‑20℃冻存；(6)胶体金溶液制备：采用柠檬酸盐还原法制备，取1000mL三角烧瓶，加入975mL双蒸水煮沸，加入15mL柠檬酸三钠继续加热5min，加入10mL1％氯金酸，继续加热至溶液呈现橘红色，冷却至室温后，4℃保存备用；(7)单克隆抗体制备：用汞离子‑螯合剂‑载体蛋白免疫小鼠，以Hg²⁺‑ITCBE‑OVA为例，说明如下：用Hg²⁺‑ITCBE‑OVA免疫6周雌性BALB/C小鼠5只，剂量为50μg/0.2mL/只，背部皮下分点注射；选择细胞融合备用小鼠，间接ELISA检测抗血清中Hg²⁺螯合物pAb效价，阻断ELISA检测Hg²⁺‑ITCBE pAb对Hg²⁺‑ITCBE的IC₅₀，挑选效价最高、IC₅₀最低的小鼠，超免用于细胞融合；采用细胞融合技术无菌取脾脏制备脾细胞，在pH8.0的50％PEG作用下与NS0骨髓瘤细胞进行融合；用间接ELISA和阻断ELISA进行阳性杂交瘤细胞株的筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行3次有限稀释克隆化；分别于冻存15d、30d和60d后复苏杂交瘤细胞，培养后取上清液，间接ELISA测定抗体效价，考察杂交瘤细胞分泌单克隆抗体的稳定性，获得一株杂交瘤细胞株；之后采用体内诱生腹水法制备Hg²⁺ITCBE‑OVA mAb，取8周龄健康Balb/c雌性小鼠，腹腔注射FIA0.5mL/只，10～15天后使用；将培养的阳性杂交瘤细胞1000rpm离心10min弃上清，收集细胞沉淀；用灭菌的PBS将细胞沉淀悬浮、混匀，将细胞数调至10⁶/mL，腹腔注射Balb/C小鼠0.5mL/只；接种细胞7‑10天后产生腹水，进行收集，于37℃水浴30min，4℃放置过夜，12000rpm离心5min，弃去上层的脂肪、IFA和下层的沉淀，饱和硫酸铵盐析法提纯后测定IgG含量和效价，‑20℃保存备用；(8)金标抗体制备：将待标单克隆抗体溶液10000r/min离心30min，用0.1mol/L K₂CO₃溶液调节胶体金溶液的pH值至8.2；根据聚沉现象，确定汞离子‑螯合剂‑载体蛋白mAb与胶体金溶液最适标记浓度，Hg²⁺‑ITCBE‑OVAmAb为0.175mg/mL；取胶体金溶液10mL，用0.1mol/L K₂CO₃溶液调节胶体金溶液的pH值至8.2；取等量的浓度为0.175mg/mL单克隆抗体溶液，磁力搅拌下混合，室温孵育15min，10000r/min离心30min，弃上清，沉淀物用含10g/L OVA、0.5g/L叠氮钠的0.02mol/LNa₂B₄O₇溶液稀释，4℃保存备用；(9)金标抗体结合垫制备：裁取规格为20×4mm的玻璃纤维棉，将金标抗体用X‑only单向喷点仪均匀喷洒于玻璃纤维棉上，37℃干燥1h，密封，4℃保存备用；(10)硝酸纤维素膜上检测线、质控线制备：将浓度为1mg/mL的汞离子‑螯合剂‑载体蛋白放于X‑only单向喷点仪贮存池A，浓度为1mg/mL的RaMIgG或者GaMIgG放于贮存池B，开机分别点射于膜中央，形成间距0.5cm的检测线和质控线，自然干燥，密封，4℃保存备用；(11)金标试纸条组装：将样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫按顺序依次粘贴于支撑板上，并在样品垫与金标抗体结合垫表面粘贴MAX线，在切槽机上切割成宽度4mm的金标试纸。