一种基于CRISPR-Cas9基因敲除技术的miR-205基因敲除试剂盒

摘要

本发明公开了一种基于CRISPR-Cas9基因敲除技术的miR-205基因敲除试剂盒。本发明通过靶标设计软件优选一定数量的miR-205的CRISPR-Cas9靶标序列，并体外合成sgRNA单链，经过处理得到插入片段，随后将sgRNA利用T4连接酶接入到质粒载体中，通过转染LNCap细胞株，持续药筛、荧光检测，得到miR-205基因敲除细胞株。通过提取细胞DNA，PCR扩增miR-205并纯化，将PCR产物变性，再退火的方式形成异源杂交双链，利用T7E1酶切试验确定CRISPR-Cas9系统对miR-205的剪切效率，获得验证优化的miR-205基因敲除CRISPR-Cas9靶序列，并以此构建应用试剂盒，可用于miR-205基因的定向敲除。该试剂盒具有基因敲除效率高、速度快、简单经济的特点，在细胞、动物模型构建及医学临床研究应用方面前景广阔。

主权项

一种基于CRISPR‑Cas9基因敲除技术的miR‑205基因敲除试剂盒，包括：1)质粒miR‑205‑Cas9，其含有一段互补的DNA序列，该DNA序列能被转录为特异识别序列如SEQ ID NO:2所示的miR‑205基因的靶标序列的sgRNA，该sgRNA能与trRNA构成特异的识别结构，以致引导Cas9酶特异地剪切miR‑205基因对应序列；2)以及配套的检测试剂，用于检测miR‑205基因的剪切效果和评估基因敲除效率。