一种微小RNA启动子活性检测的方法

摘要

本发明公开了一种微小RNA启动子活性检测的方法，该微小RNA启动子活性检测的方法包括以下步骤：利用分子生物学技术，在无启动子、增强子的真核载体基础上，构建含miRNAs启动子、miRNA和3’段侧翼序列在内的重组真核载体；将重组真核载体体外转染真核细胞，利用荧光定量PCR仪检测miRNAs成熟体的表达；通过体外实验观察启动子表达miRNAs后的生物学效应。本发明提供的微小RNA启动子活性检测的方法可以在不依赖昂贵仪器的条件下，广泛用于分子生物学和细胞生物学实验中检测miRNAs启动子活性，方便地观察miRNAs表达后的生物学效应，检测方便并准确反映启动子活性。

主权项

一种微小RNA启动子活性检测的方法，其特征在于，该微小RNA启动子活性检测的方法包括以下步骤：步骤一、首先通过GeneBank获得miRNA前段5’端‑1064位点到其3’端侧翼+124位点的序列，通过Primer5设计对应引物；根据无启动子、增强子的真核载体pGL3.0‑Basic的MCS区的酶切位点，筛选并在引物上游和下游分别引入酶切位点XhoI和BgIII；接下来抽取人肺癌95D细胞的DNA，利用PCR实验，通过引物扩增目的片度，常规纯化目的片度后，经XhoI和BgIII双酶切、纯化，与同样经XhoI和BgIII双酶切、纯化的真核载体进行连接；30分钟后，将连接产物转化DH5a感受态细胞，常规涂板后，放置37°培养箱培养12小时；挑选单个阳性克隆，在Amp+LB培养基中培养12小时，进行菌液PCR、酶切和测序鉴定；步骤二、将构建成功的重组真核载体抽提，鉴定纯度和浓度后，‑80℃保存；常规培养人肺癌95D细胞，按5×10⁴个细胞铺于24孔板中，将10ug重组载体和对照载体体外分别利用Lipofectamine2000瞬时转染细胞后，继续在5％C0₂，37℃条件下培养，48小时后，抽取各组细胞总RNA，利用Realtime PCR探针法检测miRNA表达水平；步骤三、通过体外实验观察启动子表达miRNAs后的生物学效应；利用MTT实验检测各转染组中95D细胞生长的变化；步骤一中真核载体是pGL3.0‑Basic；步骤二中miRNA是miR‑7；步骤二中重组真核载体是pGL3.0‑Basic‑miR‑7‑promoter。